גנומיקה השוואתית

1. גנומיקה השוואתית ענת אפק סמינריון בגישות מחקר בביולוגיה חישובית

2. מה נרצה לזהות בגנום? • מציאת מסגרות קריאה • מסגרות קריאה אקראיות • קריטריונים סטטיסטים שרירותיים: נפספס מסגרות קריאה קצרות • הסתכלות על גנים מתבטאים: יש גנים שלא מתבטאים תמיד • מציאת אלמנטים רגולטוריים • אין חוקים ברורים • רצפים קצרים • דרוש ידע ביולוגי מוקדם

3. גנומיקה השוואתית • הרעיון: איזורים בעלי חשיבות פונקציונלית יישמרו יותר באבולוציה בין מינים שונים. • אם נרצה ללמוד על הגנום של אורגניזם מסוים, מי הם האורגניזמים שנרצה להסתכל על הגנומים שלהם? כמה אורגניזמים דרושים?

4. מה כוחה של הגנומיקה ההשוואתית? • זיהוי טוב יותר של מסגרות הקריאה • מציאת אזורים רגולטוריים ללא צורך בידע ביולוגי מוקדם • ניתן ללמוד על קצב השינויים באבולוציה • ועוד...

5. Sequencing and comparison of yeast species to identify genes and regulatory elements M. Kellis et al., Nature 2003

6. שמר ההנצה(Saccharomyces cerevisiae) • אאוקריוט חד-תאי • הגנום שלו רוצף במלואו כבר בשנת 1996 • שלושה מיני שמר נוספים במרחקים אבולוציונים שונים משמר ההנצה • עבור כל אחד מהם רוצף כ- 95% מהגנום

7. A. P. Gasch et al. PLoS 2004

8. מין א' Sc מין ב' למה צריך להשוות ליותר מאורגניזם נוסף אחד? • השוואה בזוגות לעומת השוואה כוללת של ארבעת מיני השמרים • אמינות התוצאות גדלה

9. A 1 B 2 C 3 D 4 E 5 יישור הגנומים

10. תוצאות היישור M. Kellis et al. Nature 2003

11. תוצאות היישור - המשך • שימור סינטני גדול • סינטניות – סדר הגנים על הכרומוזום • יציבות ברמת הכרומוזומים M. Kellis et al. Nature 2003

12. קצב המוטציות – מדד להתפתחות אבולוציונית • קצב מוטציות מהיר יותר באיזורים אינטרגנים מאשר בגנים M. Kellis et al. Nature 2003

13. זיהוי גנים • חיפוש מסגרות קריאה לפי ה"חוקים" • סינון: צריך להבדיל בין מסגרות קריאה אמיתיות לכאלו שמופיעות באופן מקרי בגנום • השוואה לגנומים שונים

14. מבחן שימור מסגרות קריאה (RFC) • האם מסגרת קריאה מסוימת בשמר ההנצה היא בעלת משמעות ביולוגית או לא? • לכל מסגרת קריאה כזו נערכה "הצבעה" בין ארבעת מיני השמרים

15. עד כמה המבחן רגיש? • כביקורת שלילית נבחנו 340 רצפים אינטרגנים • המבחן קיבל 4% מהרצפים האלו • ¾ מהם התגלו כמכילים מסגרות קריאה אמיתיות • המבחן נכשל בדחיית 1% מהרצפים האינטרגנים

16. לדחות או לקבל? M. Kellis et al. Nature 2003

17. תוצאות המבחן • קטלוג מעודכן לגנום שמר ההנצה • בוטלו כ- 500 גנים • נמצאו כ- 40 גנים חדשים • כולל מסגרות קריאה המקודדות לחלבונים בגודל 50-99 ח"א • יתר דיוק יושג כשירוצפו מינים נוספים של שמר

18. הגדרה מחודשת של גנים מסוימים • נקודת התחלה וסיום תרגום • קודוני פסק נוטים לשינויים אבולוציונים גדולים יותר מאשר נקודות התחלת התרגום • אינטרונים

19. אבולוציה ברמת הגן • עבור מספר גנים של שמר ההנצה לא נמצאו אורתולוגים במינים האחרים • גנים ספציפים למין • פערים בריצוף הגנום של המינים האחרים • מה בכיוון ההפוך?

20. זיהוי גנים המצויים תחת סלקציה חיובית • ההנחה: גנים שעוברים שינויים מהירים נמצאים תחת סלקציה חיובית חזקה • Ka/Ks – מדד לעוצמת הסלקציה • זהו מדד לסלקציה חיובית - היחס בין מוטציות המשנות ח"א למוטציות שקטות • ככל שהמדד גבוה יותר פועלת פחות סלקציה משמרת

21. מה למדנו עד עכשיו? • זיהוי וביטול מסגרות קריאה • הגדרה מחדש של מבנה של גנים • אבולוציה ברמת הגנים הבודדים • זיהוי איזורים שעוברים שינויים מהירים יותר ופחות

22. זיהוי אלמנטים רגולטוריים • קשים יותר לזיהוי ממסגרות קריאה • המטרה: בניית קטלוג של אלמנטים רגולטוריים המשמשים בגנום • בסיס לחיפוש: קריטריונים שהוגדרו לפי דוגמת Gal4

23. M. Kellis et al. Nature 2003

24. מציאת מיני-מוטיבים והרחבתם למוטיבים מלאים • מיני-מוטיב הוא מהצורה XYZn(0-21)UVW • המוטיב של Gal4: CGGn(11)CCG • קריטריונים לשימור: • שימור אינטרגני • שימור אינטרגני לעומת גני • שימור upstream לעומת downstream • הרחבה למוטיבים מלאים וחישוב MCS

25. תוצאות • חפיפה עם מוטיבים ידועים • זיהוי מוטיבים חדשים M. Kellis et al. Nature 2003

26. מה עוד ניתן להשיג? • פונקציה של איזור רגולטורי • מציאת מוטיבים לפי קטגוריה • רשתות רגולטוריות

27. לסיכום המחקר... • מסגרות קריאה – זיהוי וביטול גנים • מבנה גנים • קצב שינויים באבולוציה • מציאת אלמנטים רגולטוריים ולימוד הפונקציה שלהם ללא ידע ביולוגי מוקדם

28. והלאה? • את הגישה ניתן ליישם לכל אורגניזם ע"י בחירה מתאימה של אורגניזמים להשוואה • בחירה אופטימלית של אורגניזמים • S. cerevisiae ו- S. Bayanus מרוחקים מבחינת הסתעפות הרצף כמו אדם ועכבר

29. Conservation and evolution of cis-regulatory systems in Ascomycete fungi A. P. Gasch et al., PLoS 2004

30. אבולוציה בבקרת ביטוי גנים כגורם למגוון בין המינים • קיים מגוון גדול בין אורגניזמים • יחסית מעט גנים ספציפיים למין • שפע של חלבונים הומולוגיים באורגניזמים שונים • בקרת ביטוי גנים יכולה להוות מנגנון נוסף שאחראי למגוון הגדול

31. אלמנטים ציס-רגולטוריים • מחקרים הראו קצב שינוי באבולוציה איטי יותר עבור אלמנטים אלו מאשר עבור רצפים לא פונקציונליים • שימור של אלמנטים אלו גם במינים רחוקים יחסית שלא ניתן לבצע יישור של הרצפים שלהם

32. הנחה: קבוצות גנים העוברים קו-רגולציה ישמרו על פני מינים שונים • שיטת העבודה: • לא ע"י יישור רצפים • הסתכלות על גנים העוברים קורגולציה בשמר ההנצה וחיפוש מוטיבים רגולטוריים שמבקרים אותם • נמצא אורתולוגים של קבוצות גנים אלו ונחפש בהם את רצפי הבקרה • השוואת 14 מיני פטריות בטווח מרחקים אבולוציוני גדול A. P. Gasch et al. PLoS 2004

33. קטלוג לאלמנטים ציס-רגולטוריים של שמר ההנצה • אלמנטים ידועים (ממאגרי נתונים) • חיזוי אלמנטים – שימוש ב- MEME למידע נוסף: http://meme.sdsc.edu/meme/intro.html • מקורות נוספים – Kellis et al. • סה"כ קובצו כ- 90 אלמנטים שונים A. P. Gasch et al. PLoS 2004

34. מציאת העשרה של אלמנטים ציס-רגולטוריים בקבוצות גנים העוברים קו-רגולציה בשמר ההנצה • נסתכל על גנים שעוברים קו-רגולציה בשמר ההנצה • דמיון בביטוי הגנים • קישור פיזי עם אותו פקטור שעתוק • יחסים פונקציונליים • ציון להעשרה של רצפים רגולטוריים ידועים • 41 מ- 80 רצפים נמצאים בהעשרה משמעותית • 34 מהם זוהו בקבוצת הגנים שידוע שהם מבקרים • גבול עליון של 17% זיהוי חיובי-שגוי • בדיקת העשרה של המוטיבים המתקבלים ממטריצות MEME • 4 מטריצות מייצגות כנראה מוטיבים רגולטוריים חדשים

35. חיפוש האלמנטים הרגולטוריים הקיימים בשמר ההנצה במיני הפטריות השונים • במינים קרובים היה ניתן לבצע יישור לזיהוי האלמנטים הרגולטוריים • במינים רחוקים חיפשו אורתולוגים לגנים העוברים קו-רגולציה ובדקו העשרה של הרצפים הרגולטוריים הקיימים בשמר ההנצה לכל מין בנפרד

36. חיפוש האלמנטים בשמרים נוספים - המשך • העשרה של אותם אלמנטים רגולטוריים בקבוצות הגנים האורתולוגיות במינים השונים מעידה על שימור של המערכת הציס-רגולטורית • העשרה של אלמנטים ציס-רגולטוריים במינים שונים מעידים על קו-רגולציה גם בגנים האורתולוגים, וע"י אותן מערכות ציס-רגולטוריות • רצפי ביקורת לא הראו העשרה

37. A. P. Gasch et al. PLoS 2004

38. מה עם רצפים שלא נמצאה העשרה שלהם במינים אחרים? • התפתחות של מערכות ציס-רגולטוריות • נמצאו גם מערכות ציס-רגולטוריות שמורות שלא קיימות בשמר ההנצה A. P. Gasch et al. PLoS 2004

39. שימור במיקום • peak לפיזור של אלמנטים ציס-רגולטוריים upstream לגן המטרה שלהם • נראה שימור ב- peak גם במינים אחרים • השימור הוא בפיזור ולא במיקום המדויק • שימור במרווח בין אלמנטים • מרווח לא מקרי בין אתרי הקישור של Cbf1p ו- Met31/32p

40. A. P. Gasch et al. PLoS 2004

41. אבולוציה של אלמנטים ציס-רגולטוריים – בקרת ביטוי הגנים הפרוטאוזומלים • Rpn4p מבקר ביטוי גנים פרוטאוזומלים בשמר ההנצה • שימור המערכת הציס-רגולטורית במשפחת הפטריות ה- hemiascomycetes • רצפים שונים מבקרים את ביטוי הגנים הפרוטאוזומלים ב- S. Cerevisae וב- C. Albicans

42. הבדלים בין רצפי הבקרה של גנים פרוטאוזומלים בשני המינים • הבדל בספציפיות של פקטור השעתוק הקושר את הרצף או • אותה ספציפיות לפקטורי השעתוק, וההבדל נובע מסיבות אחרות.

43. Biacore 3000 • מודד אינטראקציות מולקולריות • נבדקו תכונות הקישור של Sc_Rpn4p והאורתולוג שלו Ca_Rpn4p

44. מופיע ב-Sc בלבד מופיע ב-Ca בלבד מופיע בשניהם לשני האורתולוגים ספציפיות שונה A. P. Gasch et al. PLoS 2004

45. ל- Nc_Rpn4p כנראה תפקיד שונה • בגנים הפרוטאוזומלים של משפחת ה- Euascomycete זוהה רצף קונצנזוס אחר • האורתולוג Nc_Rpn4p מראה ספציפיות קישור זהה לזו של Ca_Rpn4p • הרצף הקיים בשמר ההנצה לא נמצא בגנים הפרוטאוזומלים של ה- Euascomycete

46. אבולוציה של מערכות ציס-רגולטוריות • גנים העוברים קו-רגולציה גם במינים אחרים אך בבקרת מערכות אחרות • קצב מהיר של שינויים – • תת-היחידות הפרוטאוזומליות והחלבונים הריבוזומאלים • קצב איטי של שינויים – • חלבונים הקשורים ב- mating

47. אבולוציה של רשתות ציס-רגולטוריות • בקרת ביטוי של גנים חדשים • קו-אבולוציה במערכות רגולטוריות • בקרת סט חדש לגמרי של גנים

48. סיכום המחקר • שימור של מערכות ציס-רגולטוריות גם במרחקים אבולוציוניים יחסית גדולים • שוני במערכות ציס-רגולטוריות: • שינוי בספציפיות הקישור של פקטור השעתוק • החדרת מטרות גנים חדשות למערכות רגולטוריות קיימות • מערכות רגולטוריות דומות יכולות לבקר סט שונה של גנים

49. מה הלאה? • ניתן להשלים את הפערים בהבנה עם ריצופם של הגנומים של פטריות נוספות במרחקי-ביניים מבחינה אבולוציונית

50. אז מה כוחה של הגנומיקה ההשוואתית? • אין צורך בידע ביולוגי מוקדם • אנליזה ברמת הגנום • ניתן ליישם את השיטה לגבי כל אורגניזם • כח השיטה עולה עם ריצופם של יותר גנומים