Amplificación de DNA in vitro : PCR (Polymerase Chain Reaction)

1. Amplificación de DNA in vitro:PCR (Polymerase Chain Reaction) Laboratorio de Genética BIOL 3300L

2. Objetivos Conocer: • Los fundamentos de la técnica de amplificación de DNA por PCR • Usos y aplicaciones del PCR • Ventajas y desventajas del PCR • Métodos de secuenciación de DNA

3. PCRPolymerase Chain Reaction • Es la amplificación de DNA in vitro por medio de la polimerización en cadena de DNA utilizando un termociclador. • El propósito del PCR es hacer muchas copias de un fragmento de DNA. • Se realiza la amplificación de un segmento específico de DNA, teniendo poco material disponible.

4. Polimerasa Chain Reaction: Reacción en Cadena de la Polimerasa • Fue diseñada por el Dr. Kary Mullis en 1987. • Ganó el premio Nóbel de Química en 1993 por su invento. • Utilizo el PCR para amplificación del gen de -hemoglobina humana, y el diagnostico prenatal de anemia falciforme.

5. Termociclador • La PCR se realiza en un “Thermo Cycler” Termociclador. • Es una máquina que calienta y enfría la reacción en periodos cortos de tiempo.

6. El proceso de “PCR” incluye 3 pasos básicos que se repiten 25 veces o más: • 1. Desnaturalización: Consiste en separar la doble hebra de DNA y convertirla en hebra sencilla. -Típicamente se usa una temperatura de 95˚C - 97˚C, por 15 a 40 segundos –el tiempo depende del tamaño del genoma-

7. 2. Apareamiento o “anneling”: • Los cebadores “primers” previamente diseñados, reaccionan con la hebra sencilla de DNA y se pegan en lugares específicos por complementariedad de bases. Para esto, se baja la temperatura -ej: 55˚C por 30 segundos-. La temperatura y el tiempo puede variar entre cebadores según sea el caso.

8. 3.Polimerización o Extensión. Una Polimerasa de DNA extiende los “primers”, en el espacio comprendido entre ambos “primers”, y coloca dinucleotidos trifosfatados (dNTP’s) de 5’a 3’ leyendo el DNA de 3’a 5’. De estas forma sintetiza la secuencia complementaria de las hebras de DNA molde Se efectúa a 70˚C por 1½ minutos (puede variar según sea necesario) Los pasos 1, 2 y 3 se repiten cuantas veces sea necesario.

10. En el PCR hay una amplificación exponencial

11. Reactivos necesarios para PCR: • Amortiguador (Buffer): 50mM KCl, 10mM Tris. Cl (pH 8.3 a temperatura ambiente) y 1.5 mM MgCl2. • MgCl2: Puede estar en forma de MgCl2, MgSO4. Se usa 25mM -Es un cofactor para la función de la polimerasa- • dNTP’s (Dinucleotidos trifosfatados): dATP, dGTP, dCTP, dTTP. -La concentración de dNTPS, es proporcional al tamaño del fragmento que se desea amplificar. Ej: Si vamos a amplificar un fragmento de 500pb vs uno de 5500 pb, necesitamos más concentración de dNTPS para el de 5500pb. -Generalmente, se usa una concentración de 200M de cada uno.

12. Reactivos necesarios para PCR: • Cebadores “primers”:Son secuencias cortas de nucleótidos 20-24 nucleótidos de longitud, complementarias a una región del DNA que se quiere amplificar. -Se usa a concentración de 1M- • DNA molde: El DNA a amplificar puede tener desde 50 a 2,000 nucleótidos de longitud. El mínimo va de 10-100 ng. y el máximo entre 400-500 ng. • Polimerasa: Generalmente se usa 2 unidades por reacción.

13. ADYUVANTES DE LA PCR • Son elementos que mejoran el rendimiento y la especificidad de la PCR. • Se usa DMSO,glicerol o BSA. • El adyuvante más utilizado es el BSA. A concentraciones por encima de 0.8 µg/µl el BSA incrementa la eficiencia de la PCR ya actúa como una proteína captadora de iones que pueden ser inhibidores de la Taq polimerasa

14. Polimerasa • En un principio, la polimerasa de DNA que se utilizaba era de la bacteria E. coli, pero esta essensitiva a alta temperatura, por lo que había que añadir enzima fresca al comenzar el tercer ciclo. • Se reemplazo la enzima por la de la bacteria “Thermus aquaticus” conocida como Taq pol

15. Análisis de la Muestra • La detección del producto de la PCR se realiza normalmente mediante corrido electroforético. • Dependiendo del tamaño de la amplificación y la resolución que deseemos utilizaremos diferentes medios (agarosa, poliacrilamida) a distintas concentraciones.

16. Análisis de la Muestra • La posterior visualización se puede realizar con bromuro de etidio (lámpara de luz UV), tinción de plata, fluorescencia, radioactividad Ladder: pesos conocidos 1: Fragmento a 1857 pb 2 y 4: Fragmento a 800 pb 3: No hay producto 5: Multiples bandas (primers inespecíficos se pegan a varios sitios)

17. Análisis de la Muestra • En algunos casos, los productos amplificados poseen secuencias que son reconocidas por endonucleasas • Hibridación, Southern Blot

18. Aplicaciones Se puede amplificar directamente de: • ADN genómico • cDNA (RT-PCR) • Detección de agentes infecciosos como: hepatitis B y C, papiloma virus, HIV, entre otros • Análisis de DNA de cualquier organismo vivo o muerto, análisis de fósiles • Mutagénesis dirigida (cambios en la información contenida a través de “primers” con mutaciones) • Investigación forense • Pruebas de paternidad

19. Aplicaciones Criminalística • Ejemplo de un caso de criminalística resuelto utilizando electroforesis en gel vertical de acrilamida. • Si se observan los patrones bandas podrá comprobarse como los perfiles obtenidos en las manchas de sangre encontradas en el sombrero (Hat) y pantalón (Jeans) del sospechoso (S) coinciden con el perfil genético de la víctima (V)

20. Utilidad del PCR

21. Ventajas del “PCR” • A partir de una muestra pequeña de ADN se puede obtener una cantidad considerable para el estudio que se vaya a realizar. • El producto se puede utilizar para clonar, secuenciar y análisis. • Se puede amplificar ADN de cualquier organismo vivo o muerto. • Sus aplicaciones son múltiples: medicina forense, diagnósticos, análisis prenatales, etc.

22. Desventajas del “PCR” • Se puede reproducir solamente partes del genoma en donde se conoce por lo menos una mínima secuencia de 20 – 40 pb. • Se necesitan “primers” específicos que sean complementarios al fragmento que se desea sintetizar. • La polimerización puede tener errores al sintetizar el ADN • Puede contaminarse con otro ADN (puede ser del mismo investigador o de cualquier otro)

23. Termociclador “Thermo cycler” Microcentrífuga Micropipetas de 2, 20 y 200 ul Microtubos para “PCR”, estériles Puntas estériles Agua destilada, desionizada y estéril ADN molde (ADN en estudio) Primer Forward y Reverse dNTP’s (dATP, dTTP, dCTP, dGTP de [25 μM] c/u) 10X buffer para PCR (Solución amortiguadora para “PCR”) MgCl2 (25mM) BSA Polimerasa Taq Materiales Para PCR

24. Fenotipo Puertorriqueño

25. Herencia del DNA mitocondrial • Amplificaremos una region hipervariable. Genoma de 16571 pares de bases: Hebra pesada (H), Hebra liviana (L). Primer Directo H34, primer reverso L15829

26. Procedimiento para extracción del DNA genómico (previamente realizado) • Se realizó un frotis bucal • El contenido del hisopo “swab” se resuspende en 1000ul de NaCl 0.9% • Centrifugar por 5 minutos a 7K • Descarta sobrenadante • Resuspender el precipitado “pellet” en 500ul de chelex al 10% • Incubar a 100˚C por 20 minutos • Centrifugar por 5 minutos a 7K • Tomar el sobrenadante ( DNA en solución) • Dejar la muestra a -20 grados hasta cuando se va a trabajar con ella Nota: El chelex actúa como agente desestabilizador de membranas y quelante.

27. Diagrama de la extracción del DNA genómico (previamente realizado)

28. Procedimiento para amplificar el DNA (PCR) • Añada los siguientes reactivos en el orden indicado: Mix 1 17.3 Mix 2 2.7 Total: 25 ul

29. Condiciones para reacción en el termociclador: 1 ciclo : 94°C por 2.5 minutos. 32 ciclos: 94 °C por 30 segundos 54 °C por 1 minutos 72 °C por 70 segundos 1 ciclo: 72 °C por 10 minutos • Lleve a reaccionar en el termociclador.

30. Secuenciación de DNA Método enzimático de terminación de cadena (método dideoxi de Sanger) • Polimerización interrumpida de ADN • Se lleva a cado polimerización de ADN en presencia de derivados dideoxi que detienen la polimerización en diferente momento, obteniéndose fragmentos de diferente tamaño. • Se examinan en electroforesis, se “lee” secuencia directamente del gel

31. Método dideoxi de Sanger

32. Método dideoxi de Sanger (2)

33. Método dideoxi de Sanger (3)

34. Método secuenciación automática

35. Electroferograma de la secuenciación automática

36. Geles de secuencia Secuencia automática Secuencia Manual

37. Direcciones de animaciones • Dirección PCR http://www.sumanasinc.com/webcontent/anisamples/molecularbiology/pcr.html • Dirección de secuenciación http://smcg.cifn.unam.mx/enp-unam/03-EstructuraDelGenoma/animaciones/secuencia.swf