RNA 干扰抑制 CD147 表达对人胃癌细胞 SGC7901 增殖、侵袭和顺铂敏感性的影响

1. RNA干扰抑制CD147表达对人胃癌细胞SGC7901增殖、侵袭和顺铂敏感性的影响RNA干扰抑制CD147表达对人胃癌细胞SGC7901增殖、侵袭和顺铂敏感性的影响 王书奎 MD, PhD 南京医科大学附属南京第一医院 2010.5.18

2. 报告内容 • 研究背景 • 研究目标 • 实验方法与结果 • 实验结论

3. 一、 研究背景

4. 胃癌概况 胃癌最常见的恶性肿瘤之一，恶性肿瘤致死占第二位 。其恶性程度较高，转移扩散严重，多数患者就诊时已属中晚期，因而死亡率较高 。

5. MMP简介 肿瘤的侵袭和转移是一个复杂的过程，其中细胞外基质和基底膜的降解是肿瘤转移过程中的重要步骤。这与细胞外基质金属蛋白酶（extracellular matrix metalloproteinase，MMP）的参与密不可分。

6. MMP是一个锌离子依赖的蛋白酶家族，目前已发现26种。MMP的主要功能是降解细胞外基质。肿瘤细胞利用MMP的基质降解能力迁移到其他部位。在肿瘤与间质交界处，MMP往往高表达 。

7. 20世纪80年代，Biswas实验室从人肺癌细胞株LX-1的细胞膜上分离得到了一种58 kDa的糖蛋白，具有刺激成纤维细胞合成MMP-1的功能，将其命名为肿瘤胶原酶刺激因子（tumor collagenase stimulating factor，TCSF）。

8. 进一步研究表明TCSF不仅能刺激MMP-1的产生，还能刺激MMP-2、MMP-3、MMP-9和MMP-11等的产生，因此将其重命名为细胞外基质金属酶诱导因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN)。 第六届人类白细胞分化抗原协作组会议将EMMPRIN命名为CD147。

9. CD147的结构 CD147属单次跨膜糖蛋白，胞外段中的4个半胱氨酸残基形成2个二硫键，构成2个典型的半球形Ig结构域。

10. 细胞内的CD147存在低糖基化（ low glycosylated CD147， LG）和高糖基化（high glycosylated CD147，HG）形式，分子量分别是32~44kDa、45~65kDa。只有HG形式能刺激MMP的产生。

11. CD147的功能 CD147是一种广泛表达于细胞表面，在体内分布广泛，参与精子发生、胚胎发育、肿瘤的侵袭和转移、炎症反应、病毒感染等多种生理和病理过程，是一个多功能的分子。

12. 免疫组化实验证实CD147在多种恶性肿瘤中高表达，包括膀胱癌、皮肤癌、肺癌、乳腺癌、淋巴癌和胰腺癌等。并且肿瘤的恶性程度越高，CD147的表达水平也越高。免疫组化实验证实CD147在多种恶性肿瘤中高表达，包括膀胱癌、皮肤癌、肺癌、乳腺癌、淋巴癌和胰腺癌等。并且肿瘤的恶性程度越高，CD147的表达水平也越高。

13. CD147在肿瘤发生发展中的作用 1. 促进肿瘤的侵袭和转移 CD147就是通过刺激成纤维细胞及肿瘤细胞本身产生多种MMP来降解基底膜和细胞外基质，从而促进肿瘤的浸润和转移的。

14. 2. 诱导肿瘤血管生成 血管内皮生长因子（vascular endothelial growth  factor ， VEGF）是很多情况下血管生成过程的主要调节因子，包括肿瘤形成过程 。CD147可以诱导VEGF的表达。

15. 3. 促进肿瘤细胞多药耐药 在多种多药耐药的肿瘤细胞中都观察到CD147的高表达。CD147可激活PI3K/AKT细胞存活信号通路。在大多数恶性肿瘤细胞中此通路均被激活。

16. 胃癌中CD147的表达 日本Toyama大学的Zheng HC等研究表明：在正常胃黏膜发展为增生性或化生性胃黏膜，最后发展为胃癌的过程中，CD147的表达量是逐渐增加的，并且CD147的表达与肿瘤大小、浸润深度、淋巴结转移以及MMP-2、MMP-9和VEGF的表达呈正相关。

17. 胃癌组织中CD147的表达 CD147在胃癌组织中高表达

18. 二. 研究目标

19. 本实验旨在运用RNA干扰技术抑制胃癌细胞株SGC7901中CD147基因的表达，研究该基因沉默后对肿瘤细胞生长、侵袭能力及化疗药物敏感性的影响，探讨CD147在胃癌中的作用。本实验旨在运用RNA干扰技术抑制胃癌细胞株SGC7901中CD147基因的表达，研究该基因沉默后对肿瘤细胞生长、侵袭能力及化疗药物敏感性的影响，探讨CD147在胃癌中的作用。

20. 三、研究方法及结果

21. CD147shRNA真核表达载体的构建与鉴定 ↓ 转染SGC7901细胞，筛选稳定表达干扰载体的SGC7901细胞株 ↓ MTT法检测SGC7901细胞增殖水平的变化 ↓ 明胶酶谱法检测SGC7901细胞MMP-2、MMP-9分泌的变化 ↓ SGC7901细胞体外侵袭力测定 ↓ MTT检测SGC7901细胞顺铂敏感性的变化 技术路线 技 术 路 线

22. 胃癌细胞株SGC7901源自一位56岁女性胃腺癌患者的淋巴结转移瘤。研究表明其侵袭能力强，恶性程度高。我们前期研究表明，该细胞表面CD147是高表达的。胃癌细胞株SGC7901源自一位56岁女性胃腺癌患者的淋巴结转移瘤。研究表明其侵袭能力强，恶性程度高。我们前期研究表明，该细胞表面CD147是高表达的。

23. shRNA（short hairpin RNA）表达载体的构建 pSilencer3.1-H1 neo

24. shRNA模板的设计示意图

25. 干扰靶序列的选择 参考陈翔等的报道，选取CD147mRNA 370-390和808-828作为靶序列，相应的shRNA分别命名为shRNA1和shRNA2。另外，设计一个阴性对照shRNA-control。

26. RNAi靶序列在CD147 mRNA上的位置 • 1 AGCGGTTGGA GGTTGTAGGA CCGGCGAGGA ATAGGAATCA TGGCGGCTGC • 51 GCTGTTCGTG CTGCTGGGAT TCGCGCTGCT GGGCACCCAC GGAGCCTCCG • 101 GGGCTGCCGG CACAGTCTTC ACTACCGTAG AAGACCTTGG CTCCAAGATA • 151 CTCCTCACCT GCTCCTTGAA TGACAGCGCC ACAGAGGTCA CAGGGCACCG • 201 CTGGCTGAAG GGGGGCGTGG TGCTGAAGGA GGACGCGCTG CCCGGCCAGA • 251 AAACGGAGTT CAAGGTGGAC TCCGACGACC AGTGGGGAGA GTACTCCTGC • 301 GTCTTCCTCC CCGAGCCCAT GGGCACGGCC AACATCCAGC TCCACGGGCC • 351 TCCCAGAGTG AAGGCTGTGA AGTCGTCAGA ACACATCAAC GAGGGGGAGA • 401 CGGCCATGCT GGTCTGCAAG TCAGAGTCCG TGCCACCTGT CACTGACTGG • 451 GCCTGGTACA AGATCACTGA CTCTGAGGAC AAGGCCCTCA TGAACGGCTC • 501 CGAGAGCAGG TTCTTCGTGA GTTCCTCGCA GGGCCGGTCA GAGCTACACA • 551 TTGAGAACCT GAACATGGAG GCCGACCCCG GCCAGTACCG GTGCAACGGC • 601 ACCAGCTCCA AGGGCTCCGA CCAGGCCATC ATCACGCTCC GCGTGCGCAG • 651 CCACCTGGCC GCCCTCTGGC CCCTCCTGGG CATCGTGGCT GAGGTGCTGG • 701 TGCTGGTCAC CATCATCTTC ATCTACGAGA AGCGCCGGAA GCCCGAGGAC • 751 GTCCTGGATG ATGACGACGC CGGCTCTGCA CCCCTGAAGA GCAGCGGGCA • 801 GCACCAGAAT GACAAAGGCA AGAACGTCCG CCAGAGGAAC TCTTCCTGAG • 851 GCAGGTGGCC CGAGGACGCT CCCTGCTCCA CGTCTGCGCC GCCGCCGGAG • 901 TCCACTCCCA GTGCTTGCAA GATTCCAAGT TCTCACCTCT TAAAGAAAAC • 951 CCACCCCGTA GATTCCCATC AT

27. 设计好的shRNA插入序列

28. 2、CD147 shRNA表达载体的构建： 将合成的三对片段分别用水浴中加热后退火备用，与经BamH I和Hind III双酶切的pSilencer3.1-neo质粒连接，构建成CD147 shRNA表达载体，重组质粒分别命名为pSilencer-shRNA1， pSilencer-shRNA2 和pSilencer-shRNA-control 。

29. pSilencer/shRNA1测序图（红线为插入片段） 重组质粒测序鉴定结果 DNA测序表明，3个重组质粒构建正确。

30. 转染及筛选 脂质体转染48h后用含0.4μg/ml的G418的完全培养基筛选2周，然后改为半量维持。将抗G418的阳性细胞克隆用有限稀释法分离出来并逐步扩增以待进一步分析。筛选出的细胞克隆分别命名为SGC7901/shRNA1，SGC7901/shRNA2和SGC7901/shRNA-control。

31. Real-time PCR检测CD147 mRNA表达水平 与SGC7901相比，SGC7901/shRNA1和SGC7901/shRNA2细胞中CD147 mRNA相对表达量分别下降至72.4%和17.3%。

32. 1 2 3 4 HG CD147 LG β-actin Lane 1: SGC7901. Lane 2: SGC7901/shRNA-control Lane 3: SGC7901/shRNA1 Lane 4: SGC7901/shRNA2 HG代表高糖基化形式的CD147，LG代表低糖基化形式的CD147。Western blot结果与Real-time PCR结果相符。

33. 接种细胞 培养细胞 加入MTT呈色 终止培养 比色 结果计算 MTT细胞增殖实验 24h、48h、72h 时间点 抑制率(%)=(对照组A 值-实验组A 值)／对照组A 值×100%

34. 与SGC7901和SGC7901/shRNA-control相比，培养24h、48h、72h后SGC7901/shRNA2细胞增殖能力均显著降低.而阴性对照组SGC7901/shRNA-control增殖能力无显著改变。与SGC7901和SGC7901/shRNA-control相比，培养24h、48h、72h后SGC7901/shRNA2细胞增殖能力均显著降低.而阴性对照组SGC7901/shRNA-control增殖能力无显著改变。

35. 明胶酶谱法检测细胞上清中MMP-2和MMP-9的活性 明胶酶包括72 kDa的明胶酶A（基质金属蛋白酶-2，MMP-2）和92 kDa的明胶酶B (基质金属蛋白酶-9，MMP-9)。其作用底物为基底膜中的Ⅳ型胶原和变性的间质胶原（明胶），其活性与肿瘤细胞侵袭和转移能力密切相关。

36. 明胶酶谱法是一种测定明胶酶活性的常用方法。收集细胞培养上清液，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法可将这两种明胶酶按分子量大小分开，显示两条负染条带，根据条带的面积和亮度可判定明胶酶的活性。明胶酶谱法是一种测定明胶酶活性的常用方法。收集细胞培养上清液，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法可将这两种明胶酶按分子量大小分开，显示两条负染条带，根据条带的面积和亮度可判定明胶酶的活性。

37. 1 2 3 MMP-9 MMP-2 Lane 1:SGC7901. Lane 2:SGC7901/shRNA-control. Lane 3:SGC7901/shRNA2 * * B 明胶酶谱结果 SGC7901/shRNA2细胞上清液中MMP-2和MMP-9的活性明显降低

38. Matrigel是从小鼠EHS肉瘤中提取的基质成分，含有层粘连蛋白、Ⅳ型胶原等。将Matrigel铺在Transwell侵袭小室的多孔滤膜上，能形成与天然基底膜极为相似的基底膜结构。Matrigel是从小鼠EHS肉瘤中提取的基质成分，含有层粘连蛋白、Ⅳ型胶原等。将Matrigel铺在Transwell侵袭小室的多孔滤膜上，能形成与天然基底膜极为相似的基底膜结构。 Transwell原理

39. SGC7901/shRNA-control SGC7901 SGC7901/shRNA2 Transwell结果 穿过Transfer侵袭小室的染成紫色的细胞（×400）

40. B * SGC7901/shRNA2细胞 体外侵袭能力显著降低

41. 顺铂敏感性实验 抗肿瘤药物顺铂的使用浓度以血浆峰浓度（ PeakPlasma Concentration，PPC) 为标准。参照Sondak等的报道，顺铂的PPC为3.0 μg/ml。 本实验中使用的顺铂浓度为：0.01PPC，0.1PPC，10PPC。细胞生长抑制率（%）=[1-OD(cisplatin＋）/OD(cisplatin－)] ×100%

42. * * * 与SGC7901和SGC7901/shRNA-control相比，顺铂对SGC7901/shRNA2的抑制率显著增加

43. 四、实验结论

44. 成功构建了靶向CD147的shRNA真核表达载体； • 成功转染了人胃癌细胞SGC7901，并获得了稳转细胞株，经Real-time PCR、Western Blot检测，CD147在mRNA和蛋白水平均被显著抑制； • CD147表达沉默后SGC7901的增殖能力明显降低，细胞的MMP-2和MMP-9的活性明显降低，细胞的体外侵袭能力明显降低，细胞对化疗药物顺铂的敏感性增强。

45. 我们的研究表明：CD147在胃癌细胞SGC7901增殖、侵袭和化疗药物敏感性中发挥重要作用；CD147可能是胃癌治疗的一个有效的靶点。我们的研究表明：CD147在胃癌细胞SGC7901增殖、侵袭和化疗药物敏感性中发挥重要作用；CD147可能是胃癌治疗的一个有效的靶点。

46. 下一步的研究方向 1.动物水平的实验（裸鼠移植瘤模型，体内肿瘤细胞 侵袭实验）； 2.CD147自身的表达调控； 3.CD147在其他消化系统肿瘤中的作用； 4.CD147多药耐药的机制。

48. Thanks for your attention!