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实验四 进行性肌营养不良症（ DMD） 基因检测

实验四 进行性肌营养不良症（ DMD） 基因检测. 进行性肌营养不良症( Duchenne muscular dystrophy，DMD) 是肌肉组织的遗传病，特点是进行性加重的肌肉萎缩和无力。 本病呈 X 连锁隐性遗传，一般男性儿童发病。. Genetics of DMD OMIM# 310200. occurring in about 1 in 3500 males, X-linked recessive, lethal in males, 1/3 of patients are new mutants; 2/3 have carrier mothers,

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实验四 进行性肌营养不良症（ DMD） 基因检测

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Presentation Transcript

  1. 实验四 进行性肌营养不良症（DMD）基因检测 • 进行性肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy，DMD)是肌肉组织的遗传病，特点是进行性加重的肌肉萎缩和无力。 • 本病呈X连锁隐性遗传，一般男性儿童发病。

  2. Genetics of DMD OMIM# 310200 • occurring in about 1 in 3500 males, • X-linked recessive, lethal in males, • 1/3 of patients are new mutants; • 2/3 have carrier mothers, • Gene location Xp21, • large gene (more than 2000 kb), 79 exons. • High mutation rate, 60% to 65% of the mutations are deletions, and about 6% are duplications , • Allelic mutations in the same gene cause a milder disorder, Becker muscular dystrophy.

  3. Duchenne Muscular Dystrophy, DMD

  4. DMD基因定位于Xq21.2-21.3之间，79个外显子组成，编码3685个氨基酸、分子量为427 kD的蛋白质一抗肌营养不良蛋白(dystrophin)，这种蛋白具有稳定细胞膜和细胞内钙调节的功能。

  5. 抗肌营养不良蛋白的编码基因有多种突变形式，60％是外显子缺失突变，通常选择DMD基因中9个缺失热点的外显子扩增，可检出缺失突变中的90%。抗肌营养不良蛋白的编码基因有多种突变形式，60％是外显子缺失突变，通常选择DMD基因中9个缺失热点的外显子扩增，可检出缺失突变中的90%。 本实验设计为扩增DMD基因中4个外显子，其中外显子45 和48在中国患者中的检出率分别为26%和48%。

  6. DMD基因4个外显子的引物顺序见表： 外显子 PCR产物大小引物F 引物R 8 360 gtcctttacacactttacctgttgag ggcctcattctcatgttctaattag 19 459 ttctaccacatcccattttcttcca gatggcaaaagtgttgagaaaaagtc 45 547 aaacatggaacatccttgtggggac cattcctattagatctgtcgccctac 48 506 ttgaatacattggttaaatcccaacatg cctgaataaagtcttccttaccacac

  7. 聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）是一种体外由引物介导的特定DNA序列的酶扩增方法，由于此方法对样本要求的微量性以及它特异、敏感、高速的特性，近年来得到广泛应用。全过程是基于一套“三步曲”的若干轮次的循环组合而成的。依次为DNA模板热变性，双链DNA解链成单链；在低温下与引物退火，引物与单链DNA互补配对；在适宜温度下Taq DNA聚合酶催化引物延伸。以上三步为一个循环，循环25-35次，模板DNA可扩增100万倍左右，整个反应可在2到3小时内完成。

  8. PCR操作如下： 每一个薄壁离心管中加入试剂的量为：（反应总体积为25l）： 双蒸水 17.8 l 10XBuffer 2.5 l MgCl2 2 l dNTPs 0.5 l Primer R+F (混合) 1.4 l DNA 模板 0.5 l Taq-DNA聚合酶 0.3 l 石蜡油 1滴 放置在PCR循环仪上，循环参数设置为： Step 1 (1个循环) 94C 5分钟 Step 2 (30个循环) 94C 30秒 56C 30秒 72C 30秒 Step 3 (1个循环) 72C 7分钟

  9. 琼脂糖凝胶电泳(agarose gel electrophoresis ): ①配制2%的琼脂糖凝胶 配制1×TBE电泳缓冲液70ml于三角烧瓶中，称取1.4克的琼脂 糖粉放入后，微波炉加热熔化,冷却至60℃，加入溴乙锭(EB)，倒入电泳槽中，插入梳子，待凝固。 ②向电泳槽中倒入1×TBE，没过胶面2mm，小心移去梳子。 ③取PCR扩增样品15l加入3l的6×载样缓冲液，混匀后，加入样品孔内。 ④ 接通电源，一般红色为正，极黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动(靠近加样孔的一端为负)。140V，电泳2小时左右。 ⑤ 卸下凝胶，于紫外仪上观察电泳条带，并与核酸分子量标准PUC19/MspⅠ(marker)比较。

  10. 2 l 6*loading buffer 10l PCR产物 混匀 加样 电泳(140V,2hr) 紫外灯下观察

  11. 注意事项： 1、引物设计时长度 15～30个碱基为宜，G+C含量一般为40%～60%。 2、退火温度决定PCR反应的特异性，退火温度高PCR反应的特异性好；温度低，有时会有非特异性条带。 3、Mg2+浓度对扩增产物的特异性及产量有显著影响，Mg2+浓度低，扩增产物的特异性好，但有时产量低；Mg2+浓度高，扩增产物的特异性差，有非特异性条带。 4、PCR循环的次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上25-30次循环后，PCR产物积累即可达到最大值。在满足产物得率的前提下，应尽量减少循环次数。

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