1 / 21

AMINOSAV

AMINOSAV. Corynebacterium glutamicum Gram-pozitív baktérium genom-szekvencia. Genetikai iformáció átviteli technikák. DNS transzfer Klónozó vektorok Integratív technikák Antibiotikum mentes „self-cloning”. Transzformáció. Protoplszt, szferoplaszt tf shuttle vektorokkal

teige
Download Presentation

AMINOSAV

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. AMINOSAV Corynebacterium glutamicum Gram-pozitív baktérium genom-szekvencia

  2. Genetikai iformáció átviteli technikák • DNS transzfer • Klónozó vektorok • Integratív technikák • Antibiotikum mentes „self-cloning”

  3. Transzformáció • Protoplszt, szferoplaszt tf shuttle vektorokkal • Glicin/penicillin , majd lizozim • PEG • 106 tf sejt/μg plazmid

  4. Transzdukció • Nem túl hatékony, cosmid, ineffektív in vitro pakolás • Kevés ismeret a fágokról • Protoplaszt transzfekció

  5. Konjugatív DNS transzfer • E. coli széles gazdaspecifikusságú RP4 plazmid alap • Trükkök: rec- recipiens, melengetés • Mobilizálható vektorral: géncsere, gén kiütés

  6. ELEKTROTRANSZFORMÁCIÓ • Spéci előnövesztés a sejtfal gyengítésére, mint protoplaszt-transzformációnál • Exponenciálisban valamivel hatékonyabb • Hatékony növesztés 18 fokon (30), eletrosokk után hősokk 6 perc 46 fokon. • Hatékonyság, mint protoplasztnál • Törzsek: restrikció mutáns/ • DNS dam/dcm, PCR termék NEM METILEZETT; éheztetett coli-ból származó DNS javul a hatékonyság

  7. VEKTOROK • Endogén plazmidokból • kriptikus plazmidokból ingázó vektorok (NÉHA BÁNTJÁK A COLI-T, csökkent növekedés, fonalas növekedés) • Heterológ antibiotikum rezisztencia gének • Más baktériumok széles gazdaspecifikusságú plazmidjaiból • Promóter csapda: reporter amiláz gén Str. griseus-ból; catI Tn9-ből; lacZ, stb. • Terminátor csapda vektorok

  8. Expressziós vektorok • E. coli és lambda rendszerek működnek C. glutamicumban • AraC-PBAD; tac, trp, lacUV promóterek • Lambda promóter-operátor-represszor rendszer • Lac IPTG indukálható variációk: • tac, trc promóterek, lacIq; szabályozott túltermeltetés

  9. INTEGRÁCIÓNAGY SZEGREGÁCIÓS STABILITÁS!!! • Géncsere konjugációval • Elektroporációval Campbell típusú integráció • Trükk: rekombináns konstrucióval transzformáljuk a restriktív gazdát; visszaizoláljuk a metilezett plazmidot, kivágjuk rep orit, ligáljuk és visszatranszformájuk vele gazdát

  10. Helyspecifikus integrációs rendszerek • Fágokból minimális, az integrációhoz szükséges rész transz hőérzékeny/nem replikálódó plazmidon; + attP a nem replikálódó plazmidon és attB a kromoszómán • 1 kópiás integrációk helyre irányítva

  11. Self-cloning: minden DNS a gazdából • Kriptikus alapplazmid + trimethoprim rezisztens dihidrofolát-reduktáz gén egy rezisztens törzsből • Klónozó és expressziós vektorok • Alanin racemáz gén: D-alanin a sejtfalban • Δalr gazda, alr plazmidon, klasszikus komplementáció

  12. Egyebek • C. glutamicum • Aminosav bioszintézis útvonalak teljes analízise • Szűk keresztmetszetek megszüntetése specifikus gének amplifikálásával • Fermentációknál probléma a nagy ozmózis nyomás • Néhány lehetséges megoldás génsebészeti módszerekkel

  13. Hogyan vizsgálhatunk esszenciális géneket? • pMUTIN

  14. IVET

More Related