Brooker R. J. Genetics . A nalysis & P rinciples Chapter 23

1. RAIDOS GENETIKA (MORFOGENETIKA) Brooker R. J. Genetics.Analysis & Principles Chapter 23

2. Žmogaus embriono raida S. Mader, Biology 9th edition

3. Įžanga Kodėl ląstelėms dalijantis atsiranda nelygiavertės, diferencijuotos ląstelės, kai jos turėtų būti vienodos, nes savyje turi vienodą genetinę informaciją? Žmogaus organizme yra daug įvairių tipų ląstelių (180 skirtingų). Visų jų pradžia – apvaisinta kiaušialąstė Morfogenetikos uždavinys yra nustatyti, kaip iš pavienių ląstelių formuojasi sudėtingas organizmas sudarytas iš specializuotų audinių ir organų. Labai dažnai atliekat morfogenezės tyrimus ląstelės perkeliamos iš vienos vietos į kitą. Tai vadinamoji ektopija (lot. ectopus- ne vietoje) Rezultatas būna trejopas - perkeltosios ląstelės: Vystosi pagal gretimų ląstelių programą Keičia toje vietoje esančių ląstelių veiklą Vystosi pagal savo programą, gretimos ląstelės neturi jokios įtakos

4. Įžanga • Daugialąsčių organizmų raida prasideda nuo apvaisintos kiaušialąstės • Tada ląstelės dalijasi, migruoja ir vis labiau keičiasi ląstelių savybės • Ląstelės tampa labai specializuotos daugialąsčiame organizme • Raidos genetika tiria genų valdančių organizmo vystymąsi veikimą • Tai labai aktyvi dinamiška genetikos tyrimų sritis • Panagrinėsime keletą pavyzdžių, kaip genai valdo vystymosi procesus 23-2

5. BESTUBURIŲ RAIDA • Du modeliniai organizmai • Drosophila melanogaster ir Caenorhabditis elegans • Kodėl Drosophila melanogaster? • Yra daug sutrikusios raidos mutantų • Pakankmai didelis organizmas, kad galima būtų atlikti transplantacijos eksperimentus • Nesunkiai galimai lokalizuotai tirti įvairių genų ekspresiją • Kodėl Caenorhabditis elegans? • Paprastos sandaros, visiškai permatomas organizmas, kurį sudaro apie 1000 somatinių ląstelių • Yra žinoma kiekvienos ląstelės dalijimosi ir diferenciacijos eiga nuo pradžios iki pabaigos 23-3

6. Ankstyvoji embriono raida • Daugialąsčio organizmo raida vyksta pagal tam tikrą kūno bendrąjį planą arba kūno modelį (ang.pattern) • Kūno modelis tai erdvinė kūno dalių išsidėstymo tvarka • Ląstelių lygmenyje kūno formavimasis reiškia ląstelių persitvarkymą ir jų specializaciją • Progresuojantis apvaisintos kiaušialąstės keitimasis ir suaugusio organizmo formavimasis apima keturių tipų pokyčius ląstelių lygmenyje • Ląstelių dalijimasis • Ląstelių judėjimas • Ląstelių diferenciacija • Ląstelių mirtis • Visų šių skirtingų pokyčių koordinuotas veikimas lemia tam tikros formos kūno formavimąsi 23-4

7. Trynys priekis užpakalis Pradžioje dalijasi tik zigotos branduoliai (9 kartus), o citoplazma lieka nepasidalijusi Branduoliai migruoja į periferiją, apie kiekvieną susiformuoja citoplazma ir apvalkalėlis Vidurinis sluoksnis Vyksta aktyvi ląstelių migracijair susidaro gastrulė Vidinis Išorinis Drozofilos raida 23-5

8. Pasibaigus embriogenzei Naujai išsiritusi lerva Subrendusi muselė Kūne išskiriamos trys ašinės linijos • Priekinė-užpakalinė (antero-posterior) • Nugarinė-pilvinė (dorsoventralinė) • Kairinė-dešininė Papildomai galūnėse išskiriama • Priekinė-galinė (proksimalinė- distalinė) Drozofilos raida

9. a • Drozofila, kaip ir kiti vabzdžiai, patiria metamorfozę • Kiaušinėlis (a) • Lerva (b) • Lėliukė (c) • Subrendusi muselė • Lervos stadijoje susiformuoja ląstelių salelės vadinami imaginai diskai, iš kurių formuojasi konkretūs suaugėlio vabzdžio organai. b a c

10. Kūno formą nulemia pozicinė informacija Raidos biologijos pozicinės informacijos koncepcija • Tam, kad organizmas įgautų specifinę iš segmentų sudarytą formą, reikia kad kiekviena ląstelė specializuotųsi į tam tikro tipo ląstelę • Tai priklauso nuo atskiros ląstelės atitinkamos buvimo vietos (pozicijos) • Pozicinė informacija veikia ląsteles keliais skirtingais būdais. Gali būti: • 1. Inicijuojamas ląstelės dalijimasis • 2. Inicijuojama ląstelės diferenciacija – keičiasi ląstelės tipas • 3. Inicijuojamaląstelės migracija • 4. Inicijuojamasląstelės mirtis! 23-10

11. Pozicinė determinacija – kūno (erdvinės) sandaros raidos eiga, kurią nergįžtamai nulemia genų produktų, branduolio ir kitų ląstelės struktūrų bei pačių ląstelių erdvinė padėtis • Morfogenai – tai molekulės, kurios perduoda pozicinę informacijąir sąlygoja raidos pokyčius • Morfogenai lemia ląstelės raidos galutinį rezultatą (ląstelės determinaciją) • Morfogenai yra baltymai, arba sudėtingi baltymų RNR kompleksai. • Šiuo metu morfogenų vieta ir pasiskirtymas tiriami molekuliniais zondais – fluorescencuojančiais antikūnais. Taip nustatoma jų vieta ir jų koncentracijos pokyčiai ovocite ir embrione. Ovocituose ir atskiruose embriono raidos etapuose morfogenai pasiskirto pagal tam tikra koncentracijos gradientą • Morfogenų veikimas prikaluso nuo jų koncentracijos. Jie turi tam tikrą slenkstinę koncentraciją • Kai morfogenų koncentraciją yra didesnė už šią slenkstinę koncentraciją - jie pasireiškia nulemdami ląstelės diferenciaciją • Kai žemensnė – morfogenų veikimas nepasireiškia 23-11

12. Tai sąlygoja pozicinę informaciją, kuri nulemia gemalo poliškumą ankstyvajame raidos etape Asimetrinis morfogenų pasiskirstymas ovocite Asimetrinis morfogenų pasiskirstymas ovocite Ląstelės sintezuojančios morfogenus Tai procesas, kurio metu ląstelė arba ląstelių grupė valdo gretimų ląstelių raidą. Tai vadinama-indukcija Mofrogenų transportas link gretimų ląstelių Asimetrinė morfogenų sintezė ir tarpląstelinis pasiskirstymas Figure 23.4 Trys pozicinės informacijos molekuliniai mechanizmai (a, b, c)

13. CAMs • Kitas, negu morfogenų, pozicinės informacijos perdavimo būdas yra ląstelių adhesija • Kiekviena ląstelė turi specifinį paviršinių receptorių rinkinį • Ląstelių adhesijos molekulės - CAMs(cell adhesion molecules) • CAM pagalba ląstelės sukimba su tarpląsteliniu matriksu (ECM- extracellular matrix ) ir/arba su kitomis ląstelėmis Ląstelė-ląstelės kontakto sąlygojama pozicinė informacija Figure 23.4 Trys pozicinės informacijos molekuliniai mechanizmai 23-13

14. Drozofilos genai, lemiantys kūno bendrojo plano (ang. pattern) raidą

15. a ir b – taikytas RNR in situ hibridizacijos metodas, c ir d – taikytas imunobiocheminis (antigenas-antikūnas) tyrimo metodas Nanoslemia pilvinės dalies formavimąsi bicoid mRNR yra susitelkusi priekiniame gale nanos mRNR yra susitelkusi užpakaliniame gale Torso receptorinio baltymo lokalizacija abiejuose galuose Toll receptorinio baltymo lokalizacija pilvinėje dalyje Figure 23.5 Kūnoašių poliškumo susiformavimas drozofilos embrione 23-16

16. bicoid molekulinis mechanizmas • bicoid geno pavadinimas atsirado dėl to, kad mutacijos atveju lervoje atsiranda du uodeginio galo dariniai (sipracle) Normaliai randamas tik užpakaliniame gale Figure 23.6 23-17

17. Bicoid demonstruoja motininių genų efektą morfogenezei • Motininiai genai lemia priekinę ir užpakalinę dalį gemalo raidos pradžioje ir valdo vėliau pasireiškiančius (sekančios hierarchijos) genus • Jeigu turime patelę, kurios fenotipas yra normalus • Fenotipiškai normali (nes jos motina buvo heterozigotinė bicoid+/bicoid-) • Bet genotipiškai mutavusi homozigotinė bicoid- /bicoid- (nes paveldėjo inaktyvuotą alelį iš savo motinos ir iš tėvo) • Tokios bicoid- /bicoid- patelės visi palikuonys (100%) bus mutantinio bicoid- tipo, net ir tuo atveju, jeigu bus sukryžminta su normaliu homozigotiniu bicoid+/bicoid+ patinėliu • Kitaip sakant, šiuo atveju motinos genotipas lemia palikuonių fenotipą • Taip yra todėl, kad bicoid geno produktą gamina motininės maitinančios ląstelės (nurse cells) ir tiekia jį ovocitui 23-18

18. Vabzdžių patelių kiaušidėse motininės maitinančios ląstelės (nurse cells) yra šalia ovocito priekinio galo • Todėl motinos genų produktai prasiskverbia į priekinį ovocito galą (bet neprasiskverbia į užpakalinį). Ši dalis vėliau tampa gemalo priekinia dalimi • bicoid genas yra aktyviai transkribuojamas motininėse maitinančiose ląstelėse • Bicoid mRNR patenka į priekinį ovocito galą ir ten susitelkia didelė šios mRNR koncentracija Figure 23.7 Motinių genų produktų patekimas į ovocitus 23-19

19. Kaip veikia Biciod • Bicoidbaltymas yratranskripcijos faktorius • Jo koncentracija įtakoja kitų genų ekspresiją • Jis stimuliuoja kito geno, hunchback geno, ekspresiją užpakalinėje embriono dalyje • Bet tokio efekto nėra priekinėje gemalo dalyje – čia hunchback ekspresija yra labai nedidelė 23-20

20. Segmentacija • Po to kai susiformuoja kūno ašys, vėlesniuose morfogenzės etapuose gemalas dalinasi į segmentus, kitaip sakant, vyksta segmentacija • Pozicinės informacijos modelis bus išlaikytas visuose tolesniuose morfogenzės etapuose, t. y. iki segmentacijos jau yra determinuota, kuri ovocito dalis bus priekis, o kuri – užpakalis, taip pat kuri dalis bus pilvas, o kuri - nugara 23-21

21. Priekis Galas (užpakalis) • Pirma formuojasi parasegmentai, po to segmentai. Atkreipkite dėmesį, kad nesutampa segmentų ir parasegmentų numeracija. • Genų ekspresijos pobūdis, kuris pasireiškia vieno parasegmento priekinėje dalyje ir gretimo parasegmento galinėje dalyje suformuoja atitinkamą segmentą • Vėliau iš atskirų segmentų susiformuos tam tikros kūno dalys, pvz: • Iš T2 segmento susiformuos krūtinė (ang. thorax) bei kojų pora ir sparnų pora • Iš A8 susidarys pilvelis (ang. abdomen) Drozofilos embriono segmentų ir parasegmentų sugretinimas

22. Segmentacijos genai lemia kūno segmentų formavimąsipradiniuose raidos etapuose • Segmentacijos genų ekspresija specifinėse embriono srityse lemia segmentų susidarymą • Yra trys segmentacijos genų tipai • gap (ang. tarpas) genai dėl kurių kiaušinėlis dalijasi į 4 plačias juostas • pair-rule (ang. pora-taisyklė) genai dėl kurių gemalas dalijasi į 7 juostas kas antras segmentas • segmentų poliškumogenai Sekančiame paveiksle parodytas mutavusių segmentacijos genų fenotipinis pasireiškimas drozofilos lervoje 23-8

23. Lervoje trūksta kiekvieno segmento priekinės dalies Lervoje trūksta lyginio numerio (kas antro) parasegmentų Lervoje trūksta didelėssegmentų grupės (nėra aštuonių priekinių) Mutavęs genas Mutavęs genas Mutavęs genas Figure 23.3 23-9

24. Segmentacijos genų veikimo hierachija

25. Homeotinai genai ir segmento fenotipas • Ląstelės determinacija (cell fate) nulemia ląstelės arba ląstelių grupės galutines savybes • Kiekviename kūno segmente drozofilos ląstelės turi savo determinuotą raidos programą ir turi ją jau labai ankstyvose embriono stadijose • Pvz.: Iš T2 segmento susiformuos krūtinė (ang. thorax) bei viena kojų pora ir sparnų pora • Sąvoka homeotinė mutacija reiškia mutantinį alelį, kai viena kūno dalis yra pakeičiama kita • Homeotiniai genai - tai genai, kurie lemia tam tikros kūno dalies (segmento) baigtinę formą 23-26

26. Drozofiloje yra dvi homeotinių genų grupės • Antennapedia kompleksas • Bithorax kompleksas • Abu kompleksai yra 3-oje chromosomoje, vieną nuo kito juos skiria didelė DNR sritis (23.10 paveikslas) • Antennapedia komplekse yra 5 genai • lab (labial) • pb (proboscipedia) • dfd (deformed) • scr (sex combs reduced) • antp (antennapedia) • Bithorax komplekse yra 3 genai • ubx (ultrabithorax) • abdA (abdominal A) • abdB (abdominal B) 23-27

27. Parodyta 4 genų ekspresijos vieta Genų išsidėstymo tvarka chromosomoje atitinka kūno dalių išsidėstymo tvarka suaugusiame organizme 23.10 pav.Drozofilos homeotinių genų ekspresija 23-28

28. Drozoliflos sutrikusios raidos mutantų tyrimai • Homeotinių genų vaidmuo buvo išaiškintas tiriant mutacijas, kurios keičia jų funkcijas • Pavyzdžiui, drozofilos antennapedia mutacija, kai antenų vietoje išauga kojų pora • Tai yra funkcijos atsiradimo nevietoje(gain-of-function) mutacija antp gene • Ji sukelia požymio pasireiškimą nebūdingoje kūno vietoje, tai yra vadinamas ektopinis(lot. ectopus-ne vietoje) organo susiformavimas • Priekinėje kūno dalyje, kur turi būti antenos susiformuoja kojų pora • Tiriamos ir kitos mutacijos, vadinamos homeotinių genų funkcijos praradimo toje vietoje(loss-of-function) mutacijos. • Kai tam tikras homeotinis genas yra pažeistas, o vietoje jo pasireiškia gretimos, labiau priekinės dalies genas 23-29

29. Drozoliflos sutrikusios raidos mutantų tyrimai • Drozofilos mutantų tyrimai pasitarnavo normalios raidos išaiškinimui ir supratimui Edward’as Lewis’as apie 1940-uosius ėmėsi tirti drozofilos bithorax mutaciją bithorax mutacija apima trijų genų kompleksą. Tai yra homeotiniai genai Normali bithorax 23-7

30. Homeotinių genų reguliavimas • Homeotiniai genai yra reguliuojami kompleksiškai • Pradinis šių genų ekspresijos pobūdis (initial pattern) yra nulemtas segmentacijos genų • polycomb genai represuoja homeotinių genų ekspresiją, tose embriono dalyse, kur jie neturi pasireikšti • Tai atlieka specialūs polycomb (pc) baltymai, kurie pertvarko chromatiną į uždarą konformaciją • Transkripcija negali vykti • trithorax genai aktyvuoja homeotinių genų ekspresiją, tose embriono vietose, kurie jie turi pasireikšti • Tai atlieka specialūs trithorax (trx) baltymai, kurie pertvarko chromatiną į atvirą konformaciją • Tai skatina transkripciją • Iš viso, bendras daugelio genų produktų veikimas lemia homeotinių genų pasireiškimą tinkamose vietose 23-30

31. Homeotiniai genai koduoja transkripcijos faktorius • Homeotinų genų koduojančios sekos turi vienodus 180 bp elementus, tai yra vadinamieji homeoboksai • Tai yra nustatyta visuose homeotiniuose genuose , o taip pati ir kituose genuose kurie lemia morfogenezę, pvz. bicoid gene • Baltymo domenas, kurį koduoja homeoboksas yra vadinamas homeodomenu • Jame yra a-spiralės motyvai, kurie sąlygoja baltymo jungimąsi DNR didžiojo griovelio vietose • Toks jungimasis specifiškai priklauso nuo sekos • Taip pat, homeotinis baltymas turi ir transkripcijos aktyvavimo domeną 23-31

32. Homeodomenų jungimosi vietos būna reguliacinėse DNR srityse (enhanseriuose) Homeotinis genas Transkripcijos aktyvacijos domenas Homeodomenas –jungimosi prie DNR vieta Homeotinis baltymas turi reguliacinę (spiralė-posūkis-spiralė) sritį, kuri jungiasi prie enhaserių vietos ir transkripcijos aktyvavimo sritį kuri jungiasi promotoriuose 23-32

33. Transkripcijos faktoriai, koduojami homeotinių genų, aktyvuoja sekančių genus, vadinamus genus realizatorius (realizatorgenes) • Šie genai suformuoja kiekvieno segmento morfologinius požymius • Genai realizatoriaikoduoja: • 1. Transkripcijosfaktorius • 2. Baltymus kurie dalyvaują ląstelė-ląstelė signalų perdavimo sąveikoje • Tikimasi, kad netolimoje ateityje bus gauta naujos informacijos, kaip veikai genai realizatoriai formuojantis morfologiniams požymiams 23-33

34. STUBURINIŲ MORFOGENZĖ • Istoriškai, morfogenzė daugiausiai tyrinėta varliagyviuose ir paukščiuose • Todėl, kad jų kiaušiniai yra pakankamai dideli ir galima nesunkai atlikti įvairias manipuliacijas • Labiausiai ištirtos stuburinių rūšys • Višta • Naguotoji varlė (Xenopus laevis) • Zebražuvė (Danio rerio) • Tarp žinduolių labiausiai ištirta naminė pelė 23-45

35. Mokslininkai aptiko homeotinius genus stuburiniuose • Daugelio stuburinių dauginimasis ir vystymasis užtrunka ilgai, o palikuonių skaičius būna gana ribotas • Todėl jiems netinka toks tyrimo metodas, kai tiriama daug embrionų ir daug palikuonių, tam, kad aptikti raidos mutantus • Šiuolaikinė molekulinė genetika leidžia pasinaudoti kitokiais metodais. Pavyzdžiui, klonuojami drozofilos genai ir naudojami kaip zondai, kad aptikti atitinkamus genus stuburinių genominėje DNR • Taikydami šį metodą mokslininkai aptiko homeotinių genų kompleksus (sankaupas) įvairiose stuburinių rūšyse • Pelės genome homeotinių genų grupės yra vadinamos Hox kompleksais. • Homeotinių drozofilos genų homologai yra nustatyti ir C. elegans, ir žinduolių, ir net augalų bei mielių genomuose • Homologija tarp žinduolių ir drozofilos homeotinių genų tokia didelė, kad pavyzdžiui perkėlus pelės Hox D4 ir Hox B6 genus į drozofilos genomą, šie perkelti genai veikia kaip natūralūs drozofilos homologai, būtent kaip Deformed ir Antennapedia genai 23-46

36. Drozofilos ir pelės homeotinių genų palyginimas Tai rodo, kad yra universlusgyvūnų morfogenezės “kūno planas ” Drozofila • Pelės genome yra rasta 13 skirtingų homeotinių genų • Tačiau nei viena iš Hox genų sankaupų, esančių keturioseskirtingose chromosomose, neturi visų 13 genų. • Iš viso keturiouose Hox kompleksuose yra 38 genai Ortologiniai genai Chromosome 6 Chromosome 11 Pelė Chromosome 15 Chromosome 2 23-47

37. Pelės Hox genų išsidėstymo tvarkos ir kūno dalių atitikimas • Hox genų išsidėstymo tvarka pelės chromosomose atitinka kūno dalių išsidėstymo tvarką nuo priekio iki užpakalio Pelės chromosomos Embrionas 23-48

38. Pelių natūralių morfogenezės mutacijų nėra daug • Tam, kad geriau perprasti genus, kuri lemia kūno formavimąsi, taikoma, vadinamoji site-specifinė mutagenzė • Tai yra vadinamoji atvirkštinė genetika (reverse genetics) • 1. Pirmiausiai identifikuojamos pelės homologinės sekos pagal drozofilos homeotinių genų sekas. Tai daroma taip: parenkami pradmenys pagal drozofilos genus ir vykdoma PGR pelės genominėje DNR. Gaunamos pelė Hox genų atkarpos, jos klonuojamos ir sekvenuojamos. • 2. In vitro sukuriama mutantinė Hox geno versija • 3. Mutantinis alelis perkeliamas atgal į pelę • 4. Sukeliama genų išveiklinimo mutacija (gene knockout), kurieliminuojama natūralią geno funkciją • Tai leidžia genetikams nustatyti, kaip mutantinis Hox alelis pasireiškia pelės fenotipe 23-49

39. Morfogenezės genai koduoja labai įvairius baltymus: - transkripcijos faktorius - transmembraninius receptorius - signalo pernašos baltymus - šaperonų tipo baltymus pairedgenaskoduoja 128 a. r. polipeptidą 3 gap genai (hb, Kr, kni) – baltymą, turintį cinko pirštelių motyvą giant– baltymą turintį leucino užtrauktuko motyvą fushi, tarasu, tailless - hormonų receptorius

40. Hox genų išsidėstymo tvarka pelės ir drozofilos chromosomose atitinka kūno dalių išsidėstymo tvarką nuo priekio iki užpakalio priekio iki užpakalio S. Mader Biology 9th

41. Didžiausias netikėtumas buvo atradimas, kad labai panašūs genai reguliuoja ir aukštesnių gyvūnų vystymąsi – tai labai konservatyvus filogenetinis kelias • Perkėlus pelių ar žmogaus homeotzinius genus muselėms vystysis normali drozofila (!)

42. Homeotinių genų žymėjimas: Žmogaus- HOX A, B,C, D Pelės –Hox – A, B,C, D Žmogaus genome yra 4 HOX genų sankaupos HOXA yra 7-oje chromosomoje HOXB yra 17-oje HOXC yra 12-oje HOXDyra 2-oje. Žmogaus segmentacijos genai žymimi PAX – 1, 2, 3… HOX/PAX genų mutacijos lemia daugelį žmogaus paveldimų ligų (lentelė) Rančelis 2000

43. PAX genų mutacijos ir ligos PAX2 – inkstų-kolobomos sindromas PAX3 – Waardenburg’o sindromas (I tipas) PAX6 - Aniridia PAX8 – skydliaukės disgenezė PAX9 - oligodontia

44. HOX genų mutacijos ir ligos • HOXA11 ir HOXD11 skeleto vystymosi sutrikimai (radioulnarinė sinostozė, dilbio defektai) ir sutrikusi magakariopoezė • HOXA13  rankos-kojų-genitalijų sindromas (hand-foot-genital syndrome(HFGS): I, V pirštų sutrumpėjimas, hypospadia♂, uterus bicornuatus ♀) • HOXD13 (10-15 Ala ekspansija) synpolydactylia