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Desintegrinas - Metaloproteasa

Desintegrinas - Metaloproteasa. Biol. Juan C. López J. Integrinas. Superfamilia de Receptores: Heterodiméricos (  y ) . Subunidades  (12 – 200 kDa) y  (90 – 110 kDa). 14 tipos subunidades  y 7 tipos de subunidades . Transmembrana. Citoadhesividad.

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  1. Desintegrinas - Metaloproteasa Biol. Juan C. López J.

  2. Integrinas • Superfamilia de Receptores: • Heterodiméricos ( y ). • Subunidades  (12 – 200 kDa) y  (90 – 110 kDa). • 14 tipos subunidades  y 7 tipos de subunidades . • Transmembrana. • Citoadhesividad. • Célula – célula y célula – matriz extracelular (ECM). • Grupo más importante de receptores para proteínas de la ECM. • Receptores para otras moléculas de adhesión. • vWF, Trombospondina • Vínculo de unión entre medio extracelular en el citoesqueleto. • Reconocen dominio unión Arg-GLy-Asp (RGD). • Morfogénesis Tisular, regeneración de tejidos, tumoración y metástasis. (Gould y cols, 1990; Wolfsberg y cols, 1995, Dzamba y cols, 2001)

  3. Designación • Integrina • IIb3 • 21 • 51 • 61 • V3 PM (kDa) 145/90 150/138 140/138 140/138 150/90 Nombre del Receptor Fibrinógeno Colágeno Fibronectina Laminina Vitronectina Designación GP GPIIb/IIIa GPIa/IIa GPIc*/IIa GPIc/IIa V/GPIIIa CD CD41a-b/CD61 CD49b/CD29 CD49e/CD29 CD49f/CD29 CD51/CD61 Integrinas (Parise y cols, 2001)

  4. Integrinas • Características Estructurales: • Subunidades  y  transmembrana asociadas no covalentemente. • Región extracelular voluminosa • Región intracitoplasmática pequeña. • Formación del heterodímero depende de la expresión en membrana de ambas subunidades. • Muestran diferentes estados de activación. • “Modulación de Afinidad”: Cambios en afinidad por unión al ligando. • Cambios conformacionales. (GPIIb/IIIa) • Regula las funciones del receptor. • Iones metálicos importantes en función adhesiva por ligando: • Motivo “EF-Hand”. • MIDAS (Metal Ion-Dependent Adhesion Site). • Mn+2 estabiliza receptores en estado activado (Alta afinidad). • Ca+2 estabiliza receptores en estado de reposo (Baja afinidad). (Dzamba y cols, 2001)

  5. Integrinas Estructura General de las Integrinas: Citoesqueleto (Gomperts y cols., 2002)

  6. Integrinas • Características Estructurales: • Diferentes combinaciones de subunidades  y  definen su afinidad y señalización que originan. • Afinidad por ligando: • Secuencias flanqueantes del dominio RDG del ligando. • Conformación del bolsillo de unión en la integrina. • Puede aumentarse por la interacción concertada de varios receptores de baja afinidad. • Ligandos multivalentes. • “Clustering” de receptores. • Interacción ligando –receptor: • Depende de Dominios-I presentes en ambas subunidades. (Dzamba y cols, 2001)

  7. Integrinas • Características Estructurales: • Subunidad : 1000 – 2000 resiudos aa. • Siete secuencias repetitivas N-terminales de aprox.60 aa. • Motivo de unión de cationes divalentes “EF Hand” • Secuencia consenso DxDxDGxxD. • Importante en función citoadhesiva y relación de cambios conformacionales – afinidad por ligando. (Dzamba y cols, 2001)

  8. Integrinas • Características Estructurales: • Subunidad : • Clasifican según características estructurales comunes: • Sitio de hidrólisis postraduccional en dominio extracelular • Presente sólo en la mitad de las subunidades  de mamíferos. • Dominio de Inserción (Dominio – I) N-terminal. • Presente en la mita de las subunidades  que cerece de sitio de hidrólisis postraduccional. • También conocido como Dominio A, similar al A3 del (vWF) para unión a colágeno. • MIDAS (Metal Ion-Dependent Adhesion Site) • Secuencia consenso DxSxS para unión de cationes (Ca+2) • Importante en función adhesiva de la subunidad. • Formas de alternativas por “splicing”. (Dzamba y cols, 2001)

  9. Integrinas Subunidad  Domino - I Subunidad  EF Hand like repeats Sitio putativo EF Hand like repeats -SH Región rica en Cys -SH -SH -SH S - I Sitio de proteólisis S - Dominios Transmembrana Dominios Citoplasmáticos (Dzamba y cols, 2001)

  10. Integrinas • Características Estructurales: • Subunidad : 760 – 790 residuos aa. • Región extracelular: 56 Cys localizadas a aprox. 50 aa de dominio transmembrana. • 5 secuencias repetitivas de 8 Cys altamente similares. • Primeras 4/5 Regiones C-terminales son similares a “EGF-like repeats” de laminina. • Confiere conformación en forma de bastón (dominio estructural). • Dominio I modificado localizado a 240 residuos de región N-terminal. • Secuencia consenso DxSxS • Importante en propiedades adhesivas de la subunidad. Invertebrados: Aparente carencia de Dominio-I subunidad . (Dzamba y cols, 2001)

  11. Integrinas • Características Estructurales: • Región Citoplasmática: • Interactúa con gran número de proteínas citoplasmáticas. • Tres tipos principales de interacción: • Interacción individual entre regiones  y : • Regulan la Modulación cambios conformacionales asociadas con afinidad. • Interacción con moléculas señalizadoras y/o adaptadoras. • Propagación de señales. • FAK, ILK, Paxilina, Sch, Grb2. • Función mecánica como eslabón entre la ECM y otras moléculas adhesivas y componentes estructurales del citoesqueleto (talina, filamina, -actina). (Dzamba y cols, 2001)

  12. Integrinas • Señalización: • “Outside-in”: • Incluye eventos como: • Progresión del ciclo celular. • Supervivencia celular. • Cambios en expresión génica. • Migración celular y reorganización del citoesqueleto. • Involucra : • interacción cruzada y paralela de señales con factores de crecimiento. •  pH intracelular, AMPc, Ca+2 intracelular, activación MAPK  expresión génica. (Dzamba y cols, 2001)

  13. Integrinas RGD ECM Factor de Crecimiento Integrinas Receptores de Factores de Crecimiento Membrana Celular Talina Ras Raf MEK ERK Progresión y diferenciación Ciclo Celular Shc Grb2 Rho FAK Paxilina FAK/Src PI3-K Cdc42 p130CAS Akt Rac Adhesión y “spreading” celular MLCK Sobrevivencia Dependiente de anclaje Migración Celular (Dzamba y cols, 2001)

  14. Integrinas • Señalización: • “Inside-out”: • Cambios conformacionales del receptor  activación. • GPIIb/IIIa (IIb3). • Plaquetas en reposo expresan el receptor en superficie. • Requiere ser activado para interacción con fibrinógeno. • Ejm: Interacción colágeno  (vWF)  GPIb/IX/V  señalización  activación GPIIb/IIIa. • Reposo: Dominio-I/3 bloquea región de unión del ligando en IIb. • Activada: Exposición de región de unión de IIb y Dominio-I/3 asume conformación activa. • Otras señales: • Trombina, ADP, TXA2 y norepinefrina. • Diferentes señales convergen hacia formación IP3 + DAG. • Otros ejemplos: • Activación y extravasación de leucocitos y migración celular. Andrews, R. 1997-1999) (Dzamba y cols, 2001 ,

  15. Integrinas Colágeno Matriz Endotelial 1 vWF 2 -S-S- -S-S- (a) PI-3K (p85) Raf-1 PKC P60src p59lyn P72syk PTP-1B GP Ib-IX-V 3 ADP Rearreglo citoesqueleto y cambio de forma (b) p125fak P60src P72syk Activación Sistema de Señales(a) Canal Ca+2 P2X1 Ca+2 Activación GPIIb-IIIa Fibrinógeno Activación Sistema de Señales(b) 5 (Andrews, R. 1997-19999)

  16. ADAM´s

  17. Desintegrinas-Metaloproteasa • A DisintegrinAndMetalloprotease (ADAM´s) • Familia de genes que codifican para proteínas con dominio MetaloproteasayDesintegrina • Superfamilia: Metaloproteasa metzincin dependiente de Zn+2. • Subfamilia : Adamalisina/Reprolisina. • ADAM´s y SVMP´s • Primera descripción por Primakoff, 1987 y Blobel y cols, 1992. • Fertilinas  y , esperma de cerdo de guinea. • Primera proteína de superficie de membrana con dominio desintegrina. ( Black y White, 1998; Schlöndorff, 1999; White y cols, 2001).

  18. Desintegrinas-Metaloproteasa • A DisintegrinAndMetalloprotease (ADAM´s) • Estructura: • Proteínas de superficie de membrana. • Filogenéticamente conservadas. • Dominios de adhesión (Desintegrina) y proteólisis. • Pueden contener dominios de fusión celular y señalización. • Funciones: • Fertilización. • Neurogénesis. • Miogénesis. • Procesamiento de ectodominios (White y cols, 2001 Schlöndorff, 1999).

  19. Desintegrinas-Metaloproteasa Metaloproteasa Tipo Desintegrina Cola Citoplasma´tica EGF like repeat Rico en Cys Transmembrana Pro ADAM 1 – Fertilina  RGD ADAM´s ADAM 2 - Fertilina  RGD ADAM 17 - TACE RGD ADAM-TS 1 Trombospondina P-I P-II P-III SVMP´s RGD RGD (White y cols, 2001).

  20. ADAM ADAM 1, Fertilina , HP-30  ADAM 2, Fertilina , HP-30  ADAM 3 ADAM 4 ADAM 5 ADAM 6 ADAM 7 ADAM 8, CD 156 ADAM 9, MDC9 ADAM 10 ADAM 11 ADAM 12, Meltrina  ADAM 19, Meltrina  ADAM 15 ADAM 17 ADAMTS-I Función/patología Fusión óvulo-esperma Fusión óvulo-esperma Fusión óvulo-esperma Fusión óvulo-esperma Fusión óvulo-esperma Fusión óvulo-esperma Fusión óvulo-esperma Infiltración PMN Señalización Degradación mielina, liberación TNF- Supresor tumoral Miogénesis Miogénesis, metaloproteasa Agregación plaquetaria, aterosclerosis Liberación TNF- caquexia Función/patología Esperma y otros Esperma Esperma Esperma y otros Esperma y otros Esperma Epidídimo PMN Pulmones y otros Hígado, bazo y otros Mamas y ovarios Hueso y músculo fetal Hueso y músculo fetal Células endoteliales ------- Corazón y riñones Desintegrinas-Metaloproteasa White y cols, 2001 refieren 33 desintegrinas diferentes (Yamamoto y cols, 1999)

  21. Desintegrinas-Metaloproteasa • Actividad Proteolítica: • 18/31: posible actividad metaloproteasa dependiente de Zn+2: • Sitio catalítico HEXGHXXGXHD. • 6/18: Actividad proteolítica demostrada experimentalmente: • ADAM´s 9, 10, 12, 13, 17 y 28. • ADAM 10: Neurogénesis. • ADAM 12 y 13: osteogénesis y miogénesis. • ADAM 17: desprende TNF de la membrana. (White y cols, 2001).

  22. Desintegrinas-Metaloproteasa ECM Metaloproteasa Metaloproteasa Desintegrina Inhibición Celular Migración Celular Desintegrina ECM Proteínas superficie integrinas Disparo señales que activa ó potencia actividad metaloproteasa Influencia del Dominio desintegrina sobre la actividad metaloproteasa (White y cols, 2001).

  23. Desintegrinas-Metaloproteasa • Cómo Péptidos de Adhesión: • Depende de dominios desintegrina y ricos en cisteína. • ADAM´s 2, 3, 9, 12, 15, 23. • Como Péptidos de Fusión: • 6/33: dependen de dominio rico en cisteína. • ADAM 1: fertilina : fertilización. • ADAM 12 y 9 : fusión de mioblastos. • ADAM 12: formación de osteoclastos. (White y cols, 2001).

  24. Desintegrinas-Metaloproteasa • Como Activador de Señalización: • Depende de domino intracelular. • 14/33 ADAM´s presentan dominio de unión de SH3. • Interacción con moléculas señalizadoras ó asociadas al citoesqueleto. • ADAM´s 9, 12, 13, 15, y 17. (White y cols, 2001).

  25. Desintegrinas-Metaloproteasa ECM ECM SVMP´s Integrina Integrina Integrina + ligando en matriz extracelular Integrina + ligando soluble ADAM´s (White y cols, 2001).

  26. Desintegrinas

  27. Desintegrinas • Familia de inhibidores de la agregación plaquetaria. • Descritos inicialmente en el venenos de la serpiente. Trimeresurus gramineus (Huang, 1987). • Capaces de interactuar con fibroblastos, osteoclastos y células de melanoma. • Pueden presentar motivo RGD (Arg-Gly Asp). • Presente en la mitad de las ADAM´s y todas las SVMP´s. • Residuo (D) importante en unión con integrinas. • Localizado en la mitad de un “protruding loop” . • Pueden presentar dominio: • RGD: Kistrina • KGD: Echistatina (Echis carinatus). • MGD: Bitistatina (Bitis arietans) (Wolfsberg y cols, 1995, White y cols, 2001).

  28. Desintegrinas • Dominio Desintegrina de las ADAM´s: • Conformación primaria de ADAM´s varía según el tipo. • Depende del ligando (integrina o receptor). • Diferentes ADAM´s pueden unirse a un mismo receptor. • Responsable de las propiedades adhesivas de la molécula. • Sólo un grupo de estas ADAM´s son funcionalmente adhesivas. (Schlöndorff, 1999, White y cols, 2001).

  29. Desintegrinas • Dominio Desintegrina de las ADAM´s: • Alta variabilidad en secuencia de los lazos. • Longitud entre 13 y 15 residuos. • Mayoría son de 14 residuos. • Residuos conservados: • Tres residuos de Cys están absolutamente conservados. • Posiciones Cys1, Cys8, Cys14. • Funciones estructurales. • También se encuentran absolutamente conservados: • Arg2, Asp9, Glu12. • Excepto ADAM´s 10 y 17 ( White y cols, 2001).

  30. Desintegrinas 1 2 8 9 12 15 Secuencias de residuos del lazo de Desintegrina en ADAM´s ( White y cols, 2001).

  31. Desintegrinas • Dominio Desintegrina de las ADAM´s: • Posiciones 7 y 9 (flancos de Cys central) • Carga negativa. • Importantes para función. • Cambios en secuencia producen diferentes efectos en diferentes ADAM´s. • Residuos centrales (5  9) son importantes para función. • Secuencias fuera del lazo desintegrina influencias la función de la misma. ( White y cols, 2001).

  32. Desintegrinas • Dominio Desintegrina de las ADAM´s: • Análisis génicos demuestran presencia de numerosos exones. • Límites intrón - exón no coinciden con los límites de los interdominios. • Pueden presentar “splicing” alternativo: • Para formas secretadas o acopladas a membrana. • Para distintas formas de dominios específicos. • Diferentes formas de dominio citoplasmático. ( White y cols, 2001).

  33. Metaloproteasa

  34. Metaloproteasa • Dominio Metaloproteasa de las ADAM´s • Importante en procesamiento “Shedding” de proteínas de membrana. • Dominios extracelulares para: • Citoquinas. • Factores de Crecimiento. • Proteínas de Adhesión. • Ejemplo: TACE (TNF-Converting Enzyme) ADAM 17. • Liberación de TNF. • TACE Zn/ Zn • Defecto en liberación del TNF • Defectos maduración epitelial de múltiples órganos. • Similares a efectos encontrados en EGFR-/- (Epidermal Growth-Factor Receptor). • TNF uno de los ligandos de EGRF. • TACE como responsable del procesamiento otros receptores. • L-Selectina y p75 TNFR. (Schlöndorff, 1999).

  35. Metaloproteasa (Schlöndorff, 1999). • Dominio Metaloproteasa de las ADAM´s • La especificidad de la interacción con sustrato depende de: • La secuencia primaria del sitio de hidrólisis en sustrato. • Secuencia desplegada de 8-10 aa cercana a sitio blanco y su distancia al dominio transmembrana. • Proyecciones dentro del sitio catalítico. • Papel como reconocedoras de estructuras específicas en sustrato. • Otros Dominios responsables: • Desintegrina y Rico en Cys. • Interacción: • Directa sobre sitio de hidrólisis • Indirecta a través de otras proteínas diferentes a la blanco. • Sustrato y proteasa expresados en la misma célula (cis) • Sustrato y proteasa expresados en diferentes células (trans)

  36. Metaloproteasa (Schlöndorff, 1999). • Dominio Metaloproteasa de las ADAM´s • Regulación del sitio catalítico: • Depende de estímulo adecuado. • Mecanismos de acción todavía por se elucidados. • Propuesta de varios modelos. • Activadores PKC, ionóforos de Ca+2, inhibidores de Tyr -P • Remoción del Pro-dominio. • Procesamiento constitutivo en trans-golgi.

  37. Metaloproteasa (Black y White, 1998; Schlöndorff, 1999). • Dominio Metaloproteasa de las ADAM´s • Regulación del sitio catalítico: • Inhibición mediada: • Zn+2 sobre residuo de Cys. • Otras proteínas inhibidoras • TIMP´s (Tissue Inhibitor of Metalloproteinase) sobre sitio catalítico de TACE. • Dominio citoplasmático. • Regula actividad en la Proteasa. • Sustrato. • TGF: Secuencia juxtamembrana extracelular • L-Selectina: Dominio citoplasmático

  38. Metaloproteasas de Venenos de Serpiente(SVMP´s)

  39. Desintegrinas-Metaloproteasa • SVMP´s (Snake Venom MetalloProtease´s). • Proteínas solubles de venenos de serpiente. • Codifican para dominio metaloproteasa similar al de ADAM´s. • Sólo algunos de los dominios metaloproteasa de ADAM´s son activos. • ADAM´s 1,8,9 y 10 son catalíticas. • ADAM´s 2, 7 y 11 NO CATALÍTICAS, diferente secuencia del sitio activo. • SVMP´s poseen dominio unión Zn+2. • Dominios metaloproteasa de SVMP´s son activos • Dominio Metaloproteasa. • Secuencia consenso en su sitio activo HEXGHNLGXXHD • H: unión del Zn+2 • G: Giro del lazo • E: (Glutámico): sitio catalítico. (Wolfsberg y cols, 1995; Yamamoto y cols, 1999)

  40. Desintegrinas-Metaloproteasa • SVMP´s: • Representadas por hemorraginas: • Relacionadas con las ADAM´s o MDC de mamíferos. • Proteínas solubles y no ancladas a membrana. • Clasificadas en: • P-I: Sólo contienen dominio metaloproteasa. • P-II: Dominio Metaloproteasa + Dominio tipo Desintegrina. • P-III: Dominio Metaloproteasa + Dominio tipo Desintegrina + Dominio rico en Cys. • P-IV: P-III + Dominio tipo Lectina en posición C-Terminal. (McLane y cols, 1998, Gutiérrez, 2000)

  41. Desintegrinas-Metaloproteasa NH2- (a)(b)(c) (d) -COOH Dominio Metaloproteasa Dominio Rico en Cys Extremo N-Terminal Dominio Desintegrina RGD Extremo C-Terminal Pro-péptido (Huang, 1988, Andrews, 2000)

  42. Desintegrinas-Metaloproteasa NH2- (a)(b) -COOH NH2- (a)(b)(c) -COOH NH2- (a)(b)(c) (d) -COOH Estructura de una Desintegrina (SVMP´s ) SVMP´s PI SVMP´s PII SVMP´s PIII (White y cols, 2001)

  43. Desintegrinas-Metaloproteasa • SVMP´s – Desintegrinas Monoméricas: • Primera desintegrina reportada: Tigramina • Trimeresusrus gramineus (Huang, 1987). • Más de 30 identificadas. • Originalmente definidas como proteínas: •  PM (49-84 aa). • Dominio RGD/KGD • Estructura de lazo mantenida por puente disulfuro. • Potente inhibidor plaquetario. • Pueden encontrarse secuencias TDE, EDE, RDE y otras. • Originadas por procesamiento proteolítico de SVMP´s tipo P-II. T: Thr (-OH); E: Glu (-(CH2)2COO-); D: Asp (-CH2COO-) (McLane y cols, 1998)

  44. Desintegrinas-Metaloproteasa • SVMP´s: – Desintegrinas Monoméricas: • Originalmente clasificadas en: • Desintegrinas cortas: • (59-51 aa) y 8 Cys. • Echistatina (Echis carnatus), Eristostatina (Eristocophis macmahoni) y Eristocophina. • Desintegrinas Medianas: • Cerca de 70 aa y 12 Cys. • Albolabrina (Trimeresurus albolabris), Tigramina (T.gramineus), Batroxostatina (Bothrops atrox). • Desintegrinas Largas: • 84 aa y 14 Cys. • Bitistatina (Bitis arietans). • Alto grado de homología en arreglo de Cys, excepto: • Cys extra en C-Terminal de desintegrinas cortas. • Puente disulfuro extra en bitistatina. (McLane y cols, 1998)

  45. Desintegrinas-Metaloproteasa • SVMP´s - Desintegrinas Monoméricas: • Secuencia RGD: • Parte de un lazo de 13 residuos: • Proyecta • Estructura mantenida por puente disulfuro. • Dominio RGD en ápice del lazo entre dos hojas  plegadas. • Conformación es vital para su actividad biológica. • Otros residuos en flancos pueden estar involucrados. • Eristostatina  IIb3. • Echistatina  IIb3, v3, 51 (fibronectina). (McLane y cols, 1998)

  46. Desintegrinas-Metaloproteasa 1 2 3 4 56 789-1011 12 13 14 (McLane y cols, 1998)

  47. Desintegrinas-Metaloproteasa • SVMP´s - Desintegrinas Medianas: • Secuencia aminoacídica similar a desintegrinas cortas. • Plegamiento difiere de desintegrinas cortas. • Comparten 7 residuos Cys conservados. • Patrones de enlace de Cys-Cys difiere. • Kistrina: fibrinógeno/IIb3 > fibronectina/IIb3 • Flavoridina: IIb3, v3, 51. • Mambina (Dendroaspis viridis, D. jamesonii): • Neurotoxina análoga tipo Desintegrina. • Similar Kistrina en secuencia lazo RGD y habilidad para unirse a IIb3. (McLane y cols, 1998)

  48. Desintegrinas-Metaloproteasa • SVMP´s - Desintegrinas Largas: • Bitistatina: • Mayor grado de homología dominio desintegrina con ADAM´s. • Casi selectiva para IIb3. • Cys5 – Cys24 específico de bitistatina. • No inhibe adhesión de HUVEC (Human Umbilical Vein Endoteliel Cells) a vitronectina (v3). • HUVEC adhiere a bitistatina inmovilizada. • Propone extremo N-terminal. • Estimula proliferación en células endoteliales aórticas de bovino. (McLane y cols, 1998)

  49. Desintegrinas-Metaloproteasa • SVMP´s - Desintegrinas Diméricas: • PM entre 13 – 15 kDa. • Subunidades heterodiméricas u homodiméricas. • Contortrostatina (Agkistrodon contortrix c): • Dos dominios RGD. • Dímero: Bloquea 51. • EMF10 (Eristocophis macmahoni): • Heterodimérica (PM 14,576 kDa). • Subunidades EMF10A y EMF10B • Muestran homología con otras desintegrinas de venenos. • Ligando para 41 (fibronectina) y 51. • Actividad inhibidora en ambas subunidades. (McLane y cols, 1998)

  50. Desintegrinas-Metaloproteasa Jararhagina NH2- (b)(c) (d) -COOH  S  S  NH2- (c) (d) -COOH NH2- (c) (d) -COOH NH2- (c) (d) -COOH Jaracetina Botrocetina de una Cadena (Andrews, 2000,)

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