黄少康，鲁兴萌 Huang Shao-kang, Lu Xing-meng 浙江大学动物科学学院无脊椎动物病理实验室

1. 家蚕微粒子虫与其形态变异株的侵染性及孢子表面蛋白的比较研究Comparative study on the infectivity and spore surface protein of Nosema bombycis and its morphological variant strain 黄少康，鲁兴萌 Huang Shao-kang, Lu Xing-meng 浙江大学动物科学学院无脊椎动物病理实验室 Lab of invertebrate pathology, Animal Science College, Zhejiang University

2. 1 引言Introduction 微孢子虫存在着大量的变异现象[2]，寄主的改变可引起微孢子虫侵染等特性的变异。据报道，寄生甘蓝夜蛾（Barathra brassicae）的微孢子虫Vairimorpha antheraeae在替代寄主大蜡螟（Galleria mellonella）中传代后，对原寄主的侵染性发生了显著变化[3]。寄生埃及伊蚊（Aedes aegypti）的微孢子虫Edhazardia aedis尽管能感染其他12种蚊子，但在这些替代寄主中失去了胚传性[4]。从野外昆虫分离的微孢子虫在感染家蚕后发生形态及侵染性变化等现象，也引起不少学者关注[5,6]。比较研究微孢子虫属种内的变异是解明侵染机理的重要途径之一。

3. 主要研究内容及方法Main contents and methods • 试验昆虫:家蚕(秋丰×白玉),桑尺蠖(野生) • 家蚕微粒子虫繁殖 • 无微孢子虫感染的桑尺蠖筛选 • 微孢子虫纯化 • 孢子形态的测量 • 孢子表面蛋白的SDS-PAGE • 孢子表面蛋白的固相双向电泳 • 24Nbh和24Nbh1对家蚕的侵染性比较

4. 2.1 无微孢子虫感染的桑尺蠖筛选Uninfected progeny of mulberry looper • 将桑园中采集的桑尺蠖幼虫，于室内大玻璃缸中用桑叶饲养，羽化后，数对雌雄蛾配对。待雌蛾产卵结束，研磨镜检雌蛾，选留未检出微孢子虫的母蛾所产的卵，于干净玻璃缸中孵化饲养，为无微孢子虫感染的桑尺蠖，用作连续添毒继代。

5. 2.2 Nbh的繁殖Microsporidia of Nbh multiplying • 　从无微孢子虫感染的桑尺蠖种群中，取约10日龄的幼虫，饥饿12h；然后将经处理过的Nb调成约104～5 spores·mL-1的浓度，涂于桑叶表面，稍为阴干后饲喂幼虫，待桑叶食尽后，再用普通桑叶饲养15d以上，用于提纯孢子，所得孢子简称为1Nbh。将1Nbh按以上方法重新添食无感染的桑尺蠖幼虫，如此连续感染24次，即得24Nbh。将24Nbh回复感染家蚕1次后，所获得的孢子简称为24Nbh-1。

6. 2.3 微孢子虫纯化Spore purification • 差速离心(500 r/min, 3 min; 3000 r/min, 10 min)+手工分离 • 高速离心(46 000g , 90min,4 ) ℃，离心90min。收集近离心管底部的微孢子层 • 蒸馏水洗涤3遍，镜检无杂质后，即得纯Nb，于-20℃保存。

7. 2.4 孢子形态的测量Spore size measurement • 测量: 分别吸取约10μl Nb及10 Nbh、15 Nbh、20 Nbh、24 Nbh 孢子悬液制片，用测微尺于油镜下（1000×）测量50颗成熟孢子的长径、短径。 • 数据分析: 用EXCEL WinSTAT软件进行显著性分析.

8. 2.5 孢子表面蛋白的SDS-PAGESDS-PAGE of spore surface protein • 孢子量: 1.3×109 spores·mL-1的纯Nb和24Nbh • 上样缓冲液的量: 70μl的2.5×SDS • 上样量: 20μl. • 胶浓度12%。 • 电泳结束后，经固定、考马氏亮蓝染色、脱色，扫描图谱.

9. 2.6 孢子表面蛋白的固相双向电泳Two-dimensional electrophoresis (2-DE) of spores surface protein • 孢子量:纯N.b、Nbh >1010spores。 • 表面蛋白提取: • 各加入0.3ml裂解液（含尿素8mol·L-1，2mol·L-1硫脲，4%（W/V）Chaps，0.5%载体两性电解质pH3.5-10，60mmol·L-1 DTT，1mmol·L-1 PMSF）。 • 超声波清洗器内冰浴振荡10min。并用塑料小杵研磨50下. • 12000r/min，4℃，离心10min。取上清待用。 • 测定样品蛋白浓度: Bradford法. • 二样品均准确上样120μg蛋白。

10. 2-DE电泳设备: IPG phorTM电泳仪，Etten DALTTM 垂直电泳系统(Amersham biotech). • 电泳程序： • 第一向IEF: 20℃，30V水化12hr；200V，1hr；1000V，1hr；8000V，80000Vhr. • 平衡:buffer I(含2g/L DDT), bufferII(含5g/L 碘乙酰胺)各平衡10min. • 第二向SDS-PAGE：12%的分离胶，稳功率电泳，每板胶功率为15W。 • 电泳结束后立即进行银染，并扫描图谱。2D重复1次。对二图谱进行比较分析。

11. 2.7 24Nbh和24Nbh1对家蚕的侵染性比较The infectivity of Nb and 24Nbh to silkworm • Nb与24Nbh的侵染性比较: • 新鲜成熟的Nb和24Nbh孢子. • 1.45×106spores·mL-15倍阶段稀释成系列浓度. • 重复: 每浓度3个重复，每重复供试2龄起蚕30条。同时设空白. • 定量饲喂: 250μl孢子液，5cm×5cm桑叶，添食24h,后正常饲养10d. • 镜检: 镊取少量中肠后部组织逐一制片镜检，记录被感染虫数. • 感染中量（IC50）计算: 按Spearman-Karber法[8].。 • Nb与24Nbh-1的侵染性比较: 方法同上.

12. 3 结果与分析Results and Analyses • 孢子形态比较: 表1 • Nb与24Nbh孢子表面蛋白: • SDS-PAGE 比较: 图1 • 双向电泳比较: 图2,3; 表2 • 24Nbh和24Nbh-1对家蚕的侵染性比较:

13. 表1 Nb与Nbh成熟孢子形态比较Table 1 Morphological comparison of Nb and Nbh mature spores 微孢子虫 Microsporidia 长径（ ±SD） Mean Length （μm） 短径（X±SD） Mean Width （μm） 长径/短径 Mean Length/Width （X±SD） Nb 4.13±0.25 A, ab 2.09±0.05 B, c 1.96±0.20 A, ab 10Nbh 3.99±0.28 AB, bc 2.19±0.26 A, a 1.84±0.22 B, bc 15Nbh 3.94±0.29 B, c 2.13±0.15 B, b c 1.86±0.18 B, b 20Nbh 3.95±0.31 B, c 2.19±0.19 AB, ab 1.82±0.21 BC, c 24Nbh 3.87±0.31 B, c 2.22±0.21 A, a 1.80±0.20 C, c 24Nbh-1 4.01±0.23 A, b 2.12±0.08 B, c 1.90±0.14 AB, b *有相同字母的均数间无显著差异，有不同字母的均数间有差异。大写字母表示差异极显著（p<0.01），小写字母表示差异显著（p<0.05）。测量数n=50。3 结果

14. 图1 Nb与24Nbh表面蛋白SDS-PAGE图谱Fig.1 SDS-PAGE profiles of Nb and 24Nbh surface protein(箭头所示蛋白Protein bands indicated by arrows: 33kD,30kD, 17kD,12kD)

15. 图2Nb及24Nbh表面蛋白2D-PAGE图谱Fig. 22D-PAGE profiles of Nb and 24Nbh surface protein

16. 图3　图2中A、B、C局部蛋白图谱对比Fig.3Focal area (A,B,C) comparing 2-DE profiles of Nb and 24Nbh in Fig.2 A B C

17. 表2Nb与24Nbh表面蛋白2D图谱部分区域蛋白相对丰度比较及其分子特性Table 2 Comparison on abundance of some Nb and 24Nbh protein spots in 2D gels and their molecular characters 微孢子虫 及分子特性Microsporidia and molecular characters 蛋白编号 Protein number 1 2* 3 4 5* 6 7 8* 9* 10 11 12 13* Nb - - - - - - ++ + + + ++ - - 24Nbh ++ + + ++ + + - - - - - ++ ++ 等电点 pI（pH） 6.5 6.3 5.7 5.8 5.7 6.1 6.6 6.1 6.5 6.5 6.7 5.2 5.1 相对分子量 MW（kD） 19 20 21 18 18 13 34 33 32 31 28 43 43 注：+/-分别表示蛋白相对丰度的高/低，*表示可能的特异差异蛋白。 Note: +/- indicate the abundance of protein in 2D-PAGE is more/less, number with asterisk showed that the protein spot was absent (-) or present (+).

18. 3.4 24Nbh和24Nbh-1对家蚕的侵染性比较The infectivity comparison between 24Nbh and 24Nbh-1 • 24Nbh和Nb IC50的比较: 24Nbh: 1.98×104 spores·mL-1 Nb: 1.72×103 spores·mL-1 24Nbh /Nb=11.5 。 • 24Nbh-1和Nb IC50的比较： 24Nbh-1: 6.56×105 spores·mL-1 Nb: 9.55×104 spores·mL-1 24Nbh-1 /Nb=6.9 • 说明Nb经桑尺蠖幼虫24次感染后，对家蚕的侵染性显著下降了，但经回复感染家蚕一次后，侵染性又明显回升，但仍与Nb差异显著。

19. 4 结论与讨论Conclusion and discussion • 寄主改变可引起微孢子虫形态的变异 Continuous pressure of alternate host can induce the variation on morphology and pathogenicity. • 寄主改变可引起微孢子虫孢子表面蛋白的变异 Spore surface protein can change greatly when the host was changed. • 孢子表面的差异蛋白是微孢子虫重要的侵染性因子 The differential proteins on spore surface are possible candidate proteins responsible for infection.

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