Download
1 / 37
390 likes | 621 Views
肉桂地链霉菌的发酵工艺优化. 张洁. 底盘细胞. ST021 菌株. 培养. 形成单菌落. 发酵. 接合转移. 选取高产菌株 作为底盘细 胞. 对底盘细胞的目标产物进行验证. 构建转化体系. ST021 发酵工艺的优化 种子培养基 : 糊精 2% ，豆粕粉 1.5% ，葡萄糖 0.5% ，酵母提取物 0.25% ，用 NaoH 调 PH6.7-6.8. 再加入 CaCO 3 0.1 %
E N D
底盘细胞 ST021菌株 培养 形成单菌落 发酵 接合转移 选取高产菌株 作为底盘细 胞 对底盘细胞的目标产物进行验证 构建转化体系
ST021发酵工艺的优化 种子培养基:糊精 2%，豆粕粉1.5%，葡萄糖0.5%，酵母提取物0.25%，用NaoH调PH6.7-6.8. 再加入CaCO3 0.1% 发酵培养基：葡萄糖4.5%，豆粕粉4%，硫酸钠0.22%，硝酸钠0.22%，氯化锰0.033%，硫酸铝0.007%，硫酸亚铁0.01%，抗坏血酸0.00019%，硫酸氢二钾0.00075%，碳酸钙0.25%， PH 6.7-6.8
第一批发酵第六天测得ST021的效价为：0.32g/L 第二批发酵第七天测得ST021的效价为：2.43g/L
存在问题 1.发酵过程中PH过高 培养1天后的种子液PH：8.05左右 第一批培养6天后的发酵液PH：8.64 第二批培养7天后的发酵液PH：7.25
计划： 1.继续优化ST021的发酵工艺，使其能够达到理想的效价。 2.继续做ST021的结合转移，构建其转化体系。 3.设计并敲除ST021聚酮合成基因，为埃霉素基因的导入做准备。
1.ST021抗性筛选 将ST021分别划线于含有Apr、Kan、Chl、tsr菌素的高氏培养中，观察知ST021对Apr有抗性，部分对Kan有抗性。
3.ST021转化体系的建立 1.与游离型质粒的结合转移 对ST021与W菌进行结合转移，将不同形态的菌落涂到含Apr和Nali的高氏培养基上，验证，然能生长。
2 整合型质粒的结合转移 将ST021与整合型质粒PIB进行结合转移，长出转化子，涂到含有Apr和Nali的高氏培养基上，仍能生长，待提基因组，验证整合到基因组的哪个位点上。
对之前筛选出来的高产菌株N4、N6、Kan-2重新进行发酵。对之前筛选出来的高产菌株N4、N6、Kan-2重新进行发酵。
结合转移 对ST021与整合型质粒进行结合转移，长出疑似转化子，用pIB的验证引物进行验证，证明PIB已经整合到ST 021的基因组上。
ST021的敲除体系 MonBⅡ，调控基因RⅠ的敲除载体构建好，进行结合转移， 并长出转化子，将转化子划线于涂有Apr和Nali的板子上进行验证。 调控基因RⅡ敲除载体构建好，进行了多次结合转移。
构建调控基因MonH的敲除载体，利用重叠延伸的方法将其同源臂及Apr片段连接起来。构建调控基因MonH的敲除载体，利用重叠延伸的方法将其同源臂及Apr片段连接起来。
ST021敲除体系 • 调控基因RⅡ（负调控基因）进入到松弛培养第五代，第四代在Apr、kan板上均能生长。 • 调控基因RⅠ（正调控基因）进入到松弛培养第四代，挑单菌落30个于高氏培养基上。 • 调控基因MonH （正调控基因）挑了20个转化子在Apr、Nali的高氏培养上验证。 • MonBⅡ进入到松弛培养第三代，挑单菌落20个于高氏培养基上生长。 • 正在构建ST021全基因敲除的载体。
ST021抗性筛选 将ST021分别划线于含有潮霉素、壮观霉素、新霉素的高氏培养中，观察ST021对这三种抗生素的抗性。
外源基因簇导入到ST021菌株中 分别将含有iso-migrastatin、Rapamycin基因簇的质粒转入到ST021的菌株中，等转化子长出后，检测这两种抗生素在ST021中的效价。
ST021敲除体系进展 • 改用液体培养基对构建的敲除菌株进行松弛培养。传2-3代之后用水把培养基洗掉，将菌丝体涂在抗性培养基上进行筛选。
调控基因MonＨ（正调控基因）出现双交换的个体，待提基因组验证（？）。调控基因MonＨ（正调控基因）出现双交换的个体，待提基因组验证（？）。 • 在斜面培养基上，MonBⅡ与调控基因MonRⅠ、MonRⅡ均出现恢复到野生型的个体，继续采用液体液体培养基对其进行传代。
ST021全基因敲除 • 同样采用λ-Red重组系统进行全基因敲除，在ST021的阅读框外分别选取未知功能域处长度为3211bp、3196bp作为上、下游同源臂。 • 将Apr片段置换到上、下游同源臂之间，待酶切验证。
将林春燕构建好的带有部分埃博霉素基因簇的游离型质粒Cos002、整合型质粒Cos004进行结合转移转入到ST021。目前Cos002长出转化子，待验证。将林春燕构建好的带有部分埃博霉素基因簇的游离型质粒Cos002、整合型质粒Cos004进行结合转移转入到ST021。目前Cos002长出转化子，待验证。
将ST021原始菌株，进行单交换菌株 RⅠ分别涂在Kan浓度为100ug/ml 、120ug/ml、150ug/ml、180ug/ml、300ug/ml、500ug/ml的斜面培养基上,分别看其所对应的抗性浓度。
继续对 RⅠ、 RⅡ、 H进行液体传代，每两天传代一次，然后吸取5ml菌丝体，用无菌水洗3次，涂在Apr的斜面培养基上。7天后在Apr板子上挑单菌落继续涂在含Apr的培养基上。
全基因敲除 将长出来验证过的转化子进行松弛培养，在固体培养基传代第一代，液体传达第二代。其余的转化子在Apr和Nali的高氏培养基上验证。
