第十三章 生物制品分析概论

1. 第十三章 生物制品分析概论

2. 第一节 概 述 药物的三大类:

3. 一、生化药物与基因工程药物的定义 生化药物: 一般系指以下三种途径获得的药物：其一，从 动物、植物及微生物分离纯化；其二、生物—— 化学半合成；其三，现代生物技术制取。该类 药物主要包括：生命基本物质及其衍生物、降 解物、大分子结构修饰物等。 例： 氨基酸、多肽、蛋白质、酶、辅酶、多糖、核苷酸和脂等。

4. 基因工程药物:在确定了对某种疾病具有预防和治疗作用基因工程药物:在确定了对某种疾病具有预防和治疗作用 的蛋白质的基础上,分离、纯化或人工合 成控制该蛋白质合成的基因，并利用重组 DNA技术进行改造，最后将该基因导入可 以大量生产的受体细胞中进行繁殖或表达 ，从而大规模生产出具有预防和治疗疾病 作用的药用蛋白质。 续定义

5. 二、生化药物与基因工程药物的种类 （一）生化药物的种类

6. 氨基酸及其衍生物类药物 • 1、单氨基酸 • 例如：亮氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、色氨酸、丙氨酸、赖氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、天门冬氨酸、精氨酸、苏氨酸等等。 • 2、氨基酸衍生物 • 例如：N-乙酰上-L-半胱氨酸、L-半胱氨酸乙酯盐酸盐、S—氨基甲酰半胱氨酸、S-甲基半胱氨酸等等。 • 3、复合氨基酸注射液 • 例如：3S、6S、9S、11S、13S、14S、15S、17S、18S复合氨基酸注射液。S代表氨基酸的种类。 种类（续）

7. 药用活性多肽 • 1、垂体多肽：例如： 促胃液素(5肽)、催产素(9肽)等。 • 2、消化道多肽：例如：胃泌素(14肽，17肽和34肽三种) • 3、下丘脑多肽：例：促甲状腺素释放激素(3肽)。 • 4、脑多肽：例：新啡肽(25肽)，-内啡肽(3l肽)等。 • 5、激肽类：例：血管紧张肽I(10肽)、Ⅱ(8肽)、Ⅲ(7肽 • )等活性肽。 • 6、其它肽类：例：谷胱甘肽(3肽)、1胸腺素(28肽) 。 种类（续）

8. 药物蛋白质 • 1、蛋白激素类药物：例如：胰岛素、生长激素 • 、催产素。 • 2、天然蛋白质类药物：例如：血清白蛋白、干 • 扰素。 • 3、蛋白质类药物制剂：例如：明胶海绵、氧化 • 聚明胶。 种类（续）

9. 酶与辅酶类药物 1、助消化酶类：例：胃蛋白酶、胰酶、胰脂肪酶。 2、蛋白水解酶类：例：溶菌酶、胰DNA酶、胶原蛋白酶。 3、凝血酶及抗栓酶：例：牛凝血酶、纤溶酶、尿激酶。 4、抗肿瘤酶：例：L-天门冬酰胺酶、组氨酸酶、精氨酸 酶。 5、其它酶类：例：超氧化物歧化酶(SOD)、RNA酶、DNA酶 、青霉素酶。 • 6、辅酶类药物：辅酶对酶的催化反应起着促进作用。 • 例：辅酶Ⅰ、辅酶Ⅱ、辅酶A、辅酶Q10、黄素单核苷酸。 种类（续）

10. 多糖类药物 • 该类药物来源广泛，以黏多糖为主，其特点为： • （1）、由糖苷键将单糖连接而成多糖。 • （2）、因单糖结构糖苷键位置不同，使多糖种类繁多， • 药理功能各异。如抗凝、降血脂、抗病毒、抗肿 • 瘤、增强免疫功能和抗衰老等多方面的生理活性。 种类（续） 例如：肝素、硫酸软骨素A和C、刺参多糖、银耳多糖、 人胎盘脂多糖、壳聚多糖。

11. 脂质类药物 • 1、磷脂：如脑磷脂、卵磷脂。 • 2、降血脂：如天然亚油酸、亚麻酸、多价不饱和脂肪酸 • （PUFA）、前列腺素PGE1、PGE2、PGF2a、 • PGI2。 • 3、胆酸：如去氧胆酸、鹅脱氧胆酸、猪脱氧胆酸。 • 4、固醇：如胆固醇、麦角固醇、-谷固醇。 • 5、卟啉：如血红素、胆红素、原卟啉。 种类（续）

12. 核酸及其降解物和衍生物类药物 • 1、核酸：例如，从小牛胸腺或鱼精中提取的DNA可用于 • 治疗精神迟缓、虚弱和抗辐射。 • 2、多聚核苷酸：例如，多聚胞苷酸、聚肌苷酸等是干扰素 • 的诱导剂，用于抗病毒、抗肿瘤。 • 3、核苷、核苷酸及其衍生物：例，ATP、cAMP、CDP-胆 • 碱、AMP、肌苷等。也可将它们进行化学修饰 • 后用于治疗肿瘤和病毒感染。治疗肿瘤的如6-巯 • 基嘌呤、2-脱氧核苷。抗病毒的如，环胞苷、 • 5-碘苷。 种类（续）

13. （二）、基因工程类药物的种类

14. 三、生化药物与基因工程药物的特点 1、共同特点： 均来自生物体,是生物体的基本生化成分,具有生物活性或生理功能,对疾病具有针对性强、毒副作用小、易于人体吸收。 2、分子量大且不是定值 小部分药物（如：氨基酸、辅酶）属化学结构明确的小分子化合物，大部分为大分子的物质(如蛋白质、多肽、核酸、多糖类等)，其分子量一般几千至几十万。对大分子的生化药物而言，即使组分相同，往往由于分子量不同而产生不同的生理活性。所以，生化药物常需进行分子量的测定。

15. 3．结构确证难 由于有效结构或分子量不确定，其结构的确证很难沿用元素分析、红外、紫外、核磁、质谱等方法加以证实，往往还要用生化法如氨基酸序列等法加以证实。 特点（续） 4、全过程质量控制 该类药物对热、酸、碱、重金属等均较敏感，往往需要对原料药、生产过程和产品进行全过程质量控制，且要求比其它药物更为严格。 5．需检查生物活性 在制备多肽或蛋白质类药物时，有时因工艺条件的变化，导致蛋白质失活。因此，对这些生化药物，除了用通常采用的理化法检验外。尚需用生物检定法进行检定，以证实其生物活性。

16. 6．需做安全性检查 由于生化药物的性质特殊。生产工艺复杂，易引入特殊杂质。故生化药物常需做安全性检查，如热原检查、过敏试验、异常毒性试验等。 特点（续） 7．需做效价测定 该类药物多数可通过含量测定，以表明其主药的含量。但对酶类药物需进行效价测定或酶活力测定，以表明其有效成分含量的高低。

17. 第二节 质量检验的基本程序与方法 一、鉴别试验 • 真伪鉴别方法 化学药物:化学方法、物理学方法 生化药物与基因工程药物:化学方法、物理学方法、生 物学方法。且需要标准品或 对照品进行对照实验。

18. （一）、理化鉴别 1、化学鉴别法 利用药物与某试剂在一定条件下反应，生成有颜色的产物或沉淀进行鉴别。 例如，溶菌酶的鉴别采用呈色法：溶茵酶分子中的四个肽键上的氮原子能与铜离子(Cu2+)络合，生成有颜色的络合物，肽键越多，产生的颜色越深。

19. 2、紫外分光光度法 由于很多生物大分子均有共轭系统,可产生特征可见紫外吸收，使较多药物能够用紫外分光光度法的特征吸收进行鉴别。 理化鉴别(续) 例如， 0.0lmol/L的三磷酸腺苷二钠的盐酸水溶液在257nm的波长处有最大吸收。用A250nm/A260nm的值0.17-0.27进行鉴别。

20. 3、高效液相色谱法 利用对照品溶液和供试品溶液色谱图的保留时间和肽图谱的一致性进行鉴别。 理化鉴别(续) 例如， 重组人生长激素的鉴别： 1）供试品与对照品的主峰保留时间一致。 2）供试品与对照品的肽图谱保持一致性。

21. （二）、生化鉴别 1、酶法 由于酶催化化学反应的高度专一性，利用特定的酶仅能催化特定的化学反应，可以有效地鉴别该药物。 例如，尿激酶是专属性较强的蛋白水解酶，根据尿激 酶能激活牛纤维蛋白溶酶原．而具有相同作用的 链激酶不能激活牛纤维蛋白溶酶原而加以区别， 并用直接观察溶解纤维蛋白作用的气泡上升法作 为判断指标。

22. 2、电泳法 基于生物大分子分子量的较大差异和荷电的差异，在电泳法中具有不同的迁移距离，从而鉴别生化药物。 生化鉴别(续) 例如，肝素的鉴别采用糖凝胶电泳法：肝素是由D-硫 酸氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸分子间组成的酸性粘 多糖，其水溶液带强负电荷，于琼脂凝胶板上， 在电场作用下，向正极方向移动，与肝素国家标 准品对照，其移动位置应对应。

23. 3、样品脱盐后用等电点聚焦法测定 基因工程药物往往有多个等电点，利用等电点聚焦从而形成多个区带，基于该区带的一致性鉴别药物。 生化鉴别(续) （三）．生物鉴别法 利用生物体进行试验来鉴别药物。 例如，用家兔惊厥试验来鉴别胰岛素，它是通过胰岛素的降血糖作用进行鉴别的。当剂量过大，血糖降低至一定水平(约30％)，家兔即发生惊厥，迅速静注50％葡萄糖注射液，补充血糖、惊厥停止，说明惊厥是胰岛素所致低血糖而引起的。

24. ▲ 生物药物鉴别应该注意以下三点： （1）药物的取样：由于生物药物多数为大分子药物，有的化学结构不明确，有的分子量不是定值，使质量控制较为困难。在大量的样品中取少量供试品进行分析，应考虑取样的科学性、真实性和代表性，其基本原则是均匀、合理。 （2）鉴别结果评价：由于生化药物的复杂性和不确定性，通常鉴别不是由一项试验完成，而是采用一组试验项目综合评价一种药物。 （3）目前仍存在相当一部分生化药物没有找到有效的鉴别方法。

25. 二、杂质检查 1、一般杂质检查 生化药物的一般杂质检查项目包括氯化物、硫酸盐、磷酸盐、铵盐、铁盐、重金属、酸度、溶液的澄清度或溶液的颜色、水分及干燥失重、炽灼残渣等。其检查的原理及方法与化学药物中的一般杂质检查相同。

26. 2．特殊杂质检查 特殊杂质主要是指从生产工艺中引入或原料中带入的杂质。许多生化药物是从生物组织中提取或用微生物发酵法制得，药物中易残存一些杂质或其他成分。 杂质检查（续） 例如，胰蛋白酶是从动物胰中提取制得的一种蛋白水 解酶，在制备过程中，易带入杂质糜蛋白酶，根据 糜蛋白酶的特性可以选用N-乙酰-L-酪氨酸乙酯为 底物作糜蛋白酶的限度检查。

27. 三、安全性检查 （一）、热原检查和细菌内毒素检查 详见第十二章药物制剂分析（P302-303） （二）、异常毒性试验 异常毒性试验是用一定剂量的药物按指定的操作方法和给药途径给予规定体重的某种试验动物，观察其急性毒性反应。反应的判断以试验动物死亡与否为终点。

28. 中国药典规定的异常毒性试验，实际上是一个限度试验。在此剂量条件下，一般供试品不应使试验动物中毒致死；如果出现试验动物急性中毒而死亡，则反映该供试品中含有的急性毒性物质超过了正常水平，因此，本试验又称异常毒性检查法。中国药典规定的异常毒性试验，实际上是一个限度试验。在此剂量条件下，一般供试品不应使试验动物中毒致死；如果出现试验动物急性中毒而死亡，则反映该供试品中含有的急性毒性物质超过了正常水平，因此，本试验又称异常毒性检查法。 安全性检查（续） • 试验动物：小白鼠。 • 试验方法：尾静脉注射法、皮下注射法、腹腔注射法及口 • 服给药法。

29. 例如，玻璃酸酶的异常毒性检查方法如：取体重17—例如，玻璃酸酶的异常毒性检查方法如：取体重17— 22g的健康小白鼠5只，分别由皮下注射每1ml中含玻 璃酸酶10000单位的氯化钠注射液0.25ml，48h内不得 发生皮下组织坏死或死亡．如有一只小白鼠发生组织 坏死或死亡，应按上述方法复试，全部小白鼠在48h 内不得有组织坏死或死亡现象。 安全性检查（续）

30. (三)、过敏试验 过敏试验是检查异性蛋白的试验。 安全性检查（续） • 原因：药物中夹杂有异性蛋白，在临床使用时易引起病人 多种过敏反应（如，皮肤红斑、血压下降、休克和 死亡等）。因此，有可能存在异性蛋白的药物、应 作过敏试验。 • 试验动物：豚鼠。 • 试验方法：皮肤过敏试验、腹腔注射试验。

31. 例如，蛋白制剂细胞色素C在制备中可能掺入杂蛋白，中国药典规定该溶液及注射液应做过敏试验。例如，蛋白制剂细胞色素C在制备中可能掺入杂蛋白，中国药典规定该溶液及注射液应做过敏试验。 安全性检查（续） • 方法：取本品适量，加灭菌注射用水稀释成每lml中含细胞色素C 7.5mg的溶液，作为致敏液与供试品溶液。另取体重为250—350g的健康豚鼠6只，连续3次隔日腹腔注射致敏液0.5ml，2周后，再自股(耳)静脉注射供试品溶液lml，注射后15min内，均不得出现过敏性反应。如有竖毛、呼吸困难、喷嚏、干呕或咳嗽三声等现象中的两种或两种以上者，或有抽搐、虚脱或死亡等现象之一者，应判为阳性。

32. (四)、降压物质检查法 降压物质是指某些药物中含有的能导致血压降低的杂质，包括组胺、类组胺或其他导致血压降低的物质。 安全性检查（续） • 杂质的来源:在用动物脏器或组织为原料制备生化药物的过程中，正常组织内存在的组胺及部分氨甚酸脱羧形成的组胺、酪胺等胺类物质，均为这类杂质的来源。 • 试验动物：猫(或狗) 。 • 试验方法：血压法检查药物中所含的降压物质 。

33. (五)、无菌试验 无菌试验是检查药品及敷料是否染有活菌的一种方法，是药典中较重要的检查项目之一。 安全性检查（续） • 原因:由于许多生化药物是在无茵条件下制备的，且不能高温灭菌。因此，无菌检查就更有必要。中国药典中几乎所有的注射用药均做无菌检查。

34. 无菌试验的基本步骤 a)、制备培养基：为细菌生长、繁殖提供所必需的营 养物质——碳源、氮源、维生素、矿物质等。 b)、选择对照用菌液：供对照试验用。 c)、具体检查：如接种、培养等操作。 d)、结果判断：得出阴性或阳性的结论。 安全性检查（续）

35. (六)、基因工程药物中可能杂质与污染物检查 安全性检查（续） • 可能杂质:残留DNA、宿主细胞蛋白质、内毒素、蛋白质突 变体、蛋白质裂解物等。 • 主要污染物:微生物、热原、病毒等。 • 主要检查项目: 1）外源性DNA 2）宿主细胞蛋白质 3）细菌内毒素 4）其它有关杂质

36. (七)、致突变试验 致突变试验一般包括：微生物回复突变试验、哺乳动 物培养细胞染色体畸变试验、啮齿动物微核试 验、微生物电极法的致突变试验。 安全性检查（续） (八)、生殖毒性试验 生殖毒性试验一般包括：一般生殖毒性试验、致畸敏感 期毒性试验、围生期毒性试验。

37. 四、含量（效价）测定 含量表示方法：通常有以下两种方法 1）百分含量表示。适用于结构明确的小分子药物或经 水解后变成小分子的药物。 2）生物效价或酶活力单位表示。适用于酶类、蛋白质 类等药物。

38. 第三节 常用定量分析方法与应用 • 定量分析方法 • 生化药物和基因工程药物常用的定量分析方法包括以下四类：

39. 定量分析方法（续） 3）生物检定法：以药物对生物体的作用效果为依据， 从而测定效价或活性。

40. 定量分析方法（续）

41. 一、理化分析法 （一）、化学分析法 1、重量法 • 基本原理： • 基于分析组分的化学、物理性质，将其溶解、挥发或转化为易于与体系分离的纯物质，再对其进行质量测定，从而获得所分析样品中被测组分的含量。

42. 常用方法： 理化分析法（续）

43. 2、滴定法 理化分析法（续） ▲ 基本原理： 若样品中被测组分与标准滴定液能够定量地、快速地发生化学反应，且该反应具有较强的选择性和适当的终点指示方法，我们将可以利用该滴定反应测定相应的化学组分。 ▲常用方法： 酸碱滴定法、氧化还原滴定法、络合滴定法。

44. (二)、电化学分析法 理化分析法（续） ▲ 基本原理： 当表面涂有敏感物质的电极与被测药物接触时,将发生电化学反应产生具有一定特征的电信号。电化学分析将利用该电信号与药物浓度成比例的关系进行药物定量分析。 ▲常用方法： 离子选择性电极分析法、化学生物传感器分析法、极谱分析法、微电流电位法。

45. (三)、光谱分析法 理化分析法（续） 1、比色法 样品中被测组分在可见紫外光区没有明显的特征吸收，但它能够与显色剂发生显色反应，生成在可见光区具有明显特征吸收的有色物质。基于该特征吸收的强弱，从而定量测定样品中的被测组分。 2、紫外分光光度法 若样品中被测组分或被测组分转化后的产物在紫外光区具有明显的特征吸收，基于该吸收分析测定被测组分。

46. 理化分析法（续） ▲比色法与紫外分光光度法的比较： 实际上，它们均是相同一类分析方法。通常比色法要进行衍生化，产生在可见光区有明显吸收的有色物质，而紫外光谱法通常不需要衍生化，若衍生化，也只是产生在紫外光区有明显吸收的物质。

47. 例如：粘多糖硫酸软骨素的比色法测定、蛋白质和糜蛋白例如：粘多糖硫酸软骨素的比色法测定、蛋白质和糜蛋白 酶的分光光度法测定 理化分析法（续）

48. 3、荧光分光光度法 具有共轭大环的分子均能产生特征荧光光谱，利用荧光强度与浓度的比例关系对生物大分子进行定量分析。 由于很多生物大分子均有荧光吸收，因此荧光分光光度法是该类物质非常重要的一种定量分析方法。 理化分析法（续）

49. (四)、色谱分析法 理化分析法（续） 1、高效液相色谱（High Performance Liquid Chromato- graphy i.e. HPLC） • 在生化药物分析中，常用的HPLC有三种： a）反相高效液相色谱（reversed phase HPLC i.e. RP-HPLC） b)高效离子交换色谱(High Performance Ion Exchange Chromatography i.e. HPIEC) c)高效凝胶过滤色谱(High Performance Gel Filtration Chromatography i.e. HPGFC).

50. (1)、反相高效液相色谱（RP-HPLC） ▲ 特 点 可以总结为以下5个方面: a）固定相：柱填料为C4、C8和C18烷基硅烷键合相。这些直链饱和烷烃是通过共价结合到硅胶载体上。最常用的为C18烷基键合相，即ODS。 b）流动相:为极性二元或三元组合溶剂，常用的为甲醇—水，乙腈—水，或甲醇、乙腈分别与缓冲液构成的多元组合溶剂。 理化分析法（续）