Gloria I. Viboud, Edison Mejía and James B. Bliska

1. Comparison of YopE and YopT activities in counteracting host signalling responses to Yersinia pseudotuberculosis infection Gloria I. Viboud,Edison Mejía and James B. Bliska Department of Molecular Genetics and Microbiology, Center for Infectious Diseases, School of Medicine, State University of New York at Stony Brook, Stony Brook, NY 11794-5222, USA.

2. Les Yersines • BGN famille des entérobactéries • 3 espèces pathogènes chez l’homme • Y. pestis : agent de la peste • Forme bubonique • Forme pulmonaire • Y. pseudotuberculosis et enterocolitica O:3, O:9, O:8, O:5 • Gastro-entérite avec adénolymphite • Formes septicémiques • Manifestations auto-immunes (erythème noueux, arthrites réactionnelles, etc…) • Système de sécrétion de type III en commun • Protéines de structures : seringue moléculaire • Protéines de translocations • Toxines et effecteurs • Plasmide de 70-75 kb en commun • Adhésines / Invasines (YadA) • Protéines antiphagocytaires (Yop) • Protéines de régulation (Lcr)

3. Pré-requis et Contexte • 6 effecteurs ciblant des molécules de signal • YopE, YopH, YopO et YopT : antiphagocytaire + AI • YopJ : AI en inactivant voies MAPK et NFκB • YopM • YopB et YopD • Propriétés de formation de pores dans les membranes • Canal de translocation • Infection de cellules en cultures • Multi-Yops mutants : pore • WT : pas de formation de pore • Occupation des canaux • Action sur voies de signal requises

4. GTPase-GDP OFF GTPase-GTP ON REG YopE YopT Cystéine protéase Famille de GTPases Rho Activation voies MAPK et NFκB Production IL-8 Cibles des effecteurs Nombreux effecteurs SST3 agissent sur une famille de GTPases Guanine nucleotide exchange factors (GEFs) GTPase-accelerating proteins (GAPs) Guanine nucleotide dissociation inhibitors (GDIs) (Prénylation post traduc)

5. Formation de pores et IL-8 par activation GTPases YopE et YopT inactivent ces GTPases • YopE et YopT inactivent RhoA,Rac1 et Cdc42 • Spécificité de substrat influencée par cellule hôte • Infection HeLa par mutant multi-Yop • Formation de pores • Production massive d’IL-8 • Expression de YopE ou YopT annulent ces effets • YopT pas exprimé dans certaines souches virulentes de Y. pseudotuberculosis Rôles respectifs de YopE et YopT ? Redondance ?

6. Recherche de l’expression de YopT Recherche de YopT sécrété par immunoblotting

7. Comparaison des plasmides de virulence pYV YPIII : souche n’exprimant pas YopT • Délétion de 1791 pb • Retrouvée par PCRdans IP2666 et YP126

8. Test de virulence • IP2666 YopT- : virulente chez la souris • Rôle respectif par construction de souches isogéniques dérivées de IP2666 • YopE- T- • YopE- T+ • YopE+ T- • YopE+ T+ • Insertion d’un plasmide contenant yopT-sycT ou yopE dans le mutant IP6 YopE-T-

9. P=0,05 Inoculation à la souris P=0,75 P=0,0047 P=0,95

10. Effet antiphagocytaire • Construction des souches dérivées de YP27 YopE-H-J-T- • YP27/vecteur • YP27/pPEYopE • YP27/pPTYopT • Culture sur tapis de cellules HeLa Test de protection à la gentamycine Test par double IF après perméation

11. Production d’IL-8 • Construction des souches dérivées de YP27 YopE-H-J-T- • YP27/vecteur • YP27/pPEYopE • YP27/pPTYopT • Mesure de l’IL-8 par ELISA sur le surnageant de culture de HeLa

12. Voies de transduction du signal mises en jeu • Production d’IL-8 stimulée par deux voies • Voie des MAPKs • Voie du NFκB • Rac1 connu pour activer • Les MAPKs JNK et p38 • La voe du NFκB • Voie ERK sous dépendance de Ras Mesure de l’activité respective de YopT et YopE Mesure de l’inactivation des MAPKs JNK, ERK et p38 Activité de la voie NFκB par mesure de IκBα

14. Inhibition de la formation de pores • Formation de pores sur HeLa par mutants multi-Yops inhibée par surexpression de YopT et YopE • Comparaison de l’activité : utilisation de mutant Yop contrôlé par promoteur naturel

15. Test d’incorporation d’EtBr / Acridine Orange

16. Discussion • Etude des profils de sécrétion des différents sérogroupes • 2 souches O:3 YopT- (YP126 et IP2666) • PCR : même délétion dans pYV • Analyse de séquences supplémentaires nécessaire • Etude de la virulence des mutants YopT • Mutant YopE-T- : virulence très atténuée chez la souris • Mutant YopE-T-/pPTYopT : virulence partiellement restaurée Première démonstration de virulence de YopT • Mutant YopE+T-/pPTYopT : virulence inchangée YopT pas indispensable à virulence de Y.p Fonction de YopT redondante à celle de YopE Rôle de YopT dans la colonisation d’autres tissus ?

17. Discussion • Activité antiphagocytaire de YopE > YopT • Montrée par 2 tests, qqsoit niveau d’expression de YopT • Différence de niveau d’activité entre les 2 tests • Différence dans les temps d’incubation (30 min contre 2h) • Internalisation de Y.p nécessite activation de Rac1 YopE est l’inhibiteur de Rac1 le plus efficace • Pas d’activité antiphagocytaire de Y.e observée sur macrophages ou PNN Mécanisme de phagocytose différent Différences génétiques entre Y.p et Y.e

18. Discussion • Différence d’inhibition IL-8 expliquée par différence d’inhibition des voies MAPKs et NFκB • YopE inhibe activation de ERK, JNK et NFκB • YopT provoque inhibition modérée • Même effet inhibiteur sur p38 Inhibition préférentielle de YopE sur Rac1 YopT agit sur RhoA : activateur mineur des voies MAPK et NFκB • YopT down-régule partiellement Rac1 • Détache Rac1 des membranes cellulaires • Entraîne translocation GTPase dans le noyau (rôle ?) • YopE > YopT inhibent Ras dépendant – ERK !? • Rac1 active PAK • PAK + Raf activent cascade ERK

19. Discussion • Inhibition de la formation de pores • Activée similaire de YopE et YopT • Précédemment : • Surexpression de RhoA et Rac1 activés restaure formation de pores par mutant multi-Yop YopE+T+ • Formation des pores annulée par inhibiteurs de polymérisation de l’actine Yop provoquent formations des pores par activation GTPases et polymérisation de l’actine Détermination des GTPases impliquées dans le mécanisme de formation des pores

20. Discussion • Gènes codant pour Yop très conservés dans les 3 espèces : pression de sélection Force motrice pour délétion de YopT ? • Etudes récentes • Y.e YopT- plus efficace pour la colonisation des certains tissus chez la souris • Infection compétitive WT / YopT- : seul YopT- persiste dans le foie après 2j d’infection chez la souris Rôle exact de YopT  avantage infectivité ?