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第二章 基因工程的工具酶和载体 第二节 克隆载体

第二章 基因工程的工具酶和载体 第二节 克隆载体. 质粒. 噬菌体. 柯斯质粒. 人工微小染色体. 载体： 携带外源 DNA 进入宿主细胞的工具。 能够运载外源 DNA 片段（目的基因）进入受体细胞，具有自我复制能力，使外源 DNA 片段在受体细胞中得到扩增和表达，不被受体细胞的酶系统所破坏的一类 DNA 分子。. 载体按功能可分为 克隆载体 表达载体. 克隆载体应具备的条件. 具有复制原点，在宿主细胞内必须能够自我复制。 有一个或多个用于筛选的选择标记。 具备合适的限制性核酸内切酶的单一识别位点。 有较高的拷贝数。. 克隆载体包括：

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第二章 基因工程的工具酶和载体 第二节 克隆载体

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  1. 第二章 基因工程的工具酶和载体 第二节 克隆载体 质粒 噬菌体 柯斯质粒 人工微小染色体

  2. 载体：携带外源DNA进入宿主细胞的工具。 能够运载外源DNA片段（目的基因）进入受体细胞，具有自我复制能力，使外源DNA片段在受体细胞中得到扩增和表达，不被受体细胞的酶系统所破坏的一类DNA分子。

  3. 载体按功能可分为 克隆载体 表达载体

  4. 克隆载体应具备的条件 • 具有复制原点，在宿主细胞内必须能够自我复制。 • 有一个或多个用于筛选的选择标记。 • 具备合适的限制性核酸内切酶的单一识别位点。 • 有较高的拷贝数。

  5. 克隆载体包括： 质粒载体 噬菌体载体 人工构建的载体（黏粒和人工微小染色体）

  6. 一 、 质粒载体 1.质粒的一般生物学特性： （1）质粒的概念：是存在于细胞质中一类独立于染色体外的可自主复制的遗传成分，绝大多数质粒为共价闭合环状双链DNA，少数是线性。

  7. 天然质粒

  8. （2）质粒的自主复制性 质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制，质粒DNA的复制受质粒和宿主细胞双重遗传系统的控制。 质粒拷贝数：指宿主细菌在标准培养条件下，每个细菌细胞中含有的质粒数目。

  9. 按照质粒控制拷贝数的程度，可将质粒的复制方式分为松弛型和严谨型两种 松弛型：10-200 拷贝（加氯霉素扩增） 严谨型：1-10 拷贝

  10. （3）质粒的不相容性 任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质粒组成不相容性群。

  11. (4)质粒的可转移性 接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等 非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用如Col、R的其它成员。

  12. （5 ）携带特殊的遗传标记 野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括： 氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因、氯霉素抗性基因、卡那霉素和新霉素抗性基因、lacZ’基因 这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义！

  13. lacZ′基因α互补显色的原理

  14. LacZ基因表达的蓝白斑菌落 空转化子：蓝色 重组子：白色

  15. 2.质粒载体应具备的条件 （1）拷贝数较高。 （2）分子量较小。 （3）具有选择标记。抗性是常用的选择标记。 （4）具有较多的限制性酶切位点。MCS （5）具有复制起始点。

  16. 3.常用的克隆质粒 （1）pBR322质粒载体： 1977年，F Bolivar & R L Rodriguez构建 全长4362 bp 松驰型质粒 Ampr，Tetr 多种限制性酶切位点

  17. pBR322结构图

  18. pBR322 质粒克隆外源基因的过程

  19. （2）pUC质粒： • pUC 18/pUC 19 全长2674 bp ，有Amp 抗性基因，带有lac Z′基因。 • 一个复制起点ori。因在复制起点ori区域内缺失rop 基因（改进的pMB1复制子），细胞即使生长在无氯霉素环境中也可形成高拷贝数（500-700）。

  20. pUC 18/pUC 19 质粒结构

  21. pUC质粒的优点：1）突变位点位于复制起点，提高了拷贝数。2) 重组子的鉴定可一步完成，固体培养基中添加amp和X-gal, IPTG，节约了一半的时间。3）多克隆位点，可以使具有不同粘端的DNA片段插入载体，而不必连接linker。4）载体中的多克隆位点与M13mp系列的载体是相同的，因此，插入pUC系列的克隆DNA可以直接转入M13mp载体，可以进行DNA测序和体外定点突变。

  22. pGEM 质粒结构

  23. 改建质粒的要求 • 尽可能使质粒缩小，以便插入更大的外源DNA片段； • 增加多种酶切位点； • 增加标记基因； • 提高外源DNA的表达水平； • 增加质粒在受体细胞中的拷贝数

  24. 质粒载体总体评价 优点：种类多，改建方便，筛选方便，操作简单，DNA提取容易 缺点：装载容量有限，＜10Kb

  25. 二、λ噬菌体 • λ噬菌体DNA 是线性双链DNA分子，48.5kb • 噬菌体λ粒子，DNA线性双链，带有12bp的粘性末端，称为cos位点。 噬菌体感染细菌以后，双链DNA分子通过COS位点成环状 • λ基因组三个区域： 左侧：包括外壳蛋白基因，20kb 中间区：18kb 右侧：复制及裂解基因，12kb λDNA+外源DNA之和必须在39-53kb之间，所以可插入7-21kb外源片段

  26. l 噬菌体生物学特性：生物结构 黏性末端 溶菌控制基因 cos 头部合成基因 晚期控制基因 DNA合成控制基因 阻遏基因 l - DNA 早期控制基因 尾部合成基因 阻遏基因 重组基因 删除与整合基因 COS 3’ CCCGCCGCTGGA 5’ 5’ TCCAGCGGCGGGG 3’ COS

  27. λ-DNA载体的构建：删除重复的酶切位点 野生型的l-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不利于重组操作，必须删除至1 -2个 同时，为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加一些单一的酶切位点。如利用酶切和采用定点突变技术去除或增加酶位点 增加标记基因lacZ

  28. λ噬菌体插入型和替换型载体

  29. 利用λ噬菌体载体克隆外源DNA的过程

  30. l-DNA作为载体的优点： l-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌 l-DNA载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒的装载量 重组l-DNA分子的筛选较为方便 重组l-DNA分子的提取较为简便 l-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达 外源基因

  31. 三、M13单链噬菌体 M13噬菌体的生物学特性：生物结构 M13噬菌体的外型呈丝状 M13噬菌体由外壳包装蛋白和正链DNA组成 M13DNA全长6407个核苷酸 M13 DNA上至少有10个基因 M13噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长

  32. M13噬菌体的生活周期

  33. M13噬菌体载体的结构

  34. M13噬菌体载体的应用

  35. 四、考斯质粒 • 1978年由Collins和Hohn改建 •正常的质粒与噬菌体的cos位点构成 •有Ampr抗性基因 •Cos位点可识别噬菌体的外壳蛋白，可被包装 •包装能力：30-40kb

  36. 柯斯质粒（cosmid）的结构

  37. 考斯质粒（cosmid） 考斯质粒载体的特点： 能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞 能像质粒那样在受体细胞中自主复制 重组操作简便，筛选容易 装载量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范围 不能体内包装，不裂解受体细胞

  38. 五、人工微小染色体 YAC载体应含有下列元件： 酵母染色体的端粒序列 酵母染色体的复制子 酵母染色体的中心粒序列 酵母系统的选择标记 大肠杆菌的复制子 大肠杆菌的选择标记 YAC载体的装载量为800 -1000 kb

  39. 酵母人工染色体结构

  40. 优点：装载容量大，酵母细胞克隆 缺点：基因分离困难，需亚克隆 酵母人工染色体的应用

  41. 克隆载体的发展历史 第一代：环状质粒，装载8-10个kb片段; 第二代：经过改建的病毒，装载能力２０kb左右; 第三代：cosmid,装载能力30-40kb; 第四代: YAC, 装载能力1-2 Mb; 第五代: 新型载体: BAC, PAC, MAC, Fosmid 等,装载能力80-200kb

  42. 思考题 1、第一个作为重组DNA载体的质粒是( ) (a)pBR322 (b)ColEl (c)pSCl01 (d)pUCl8 2、同一种质粒DNA以三种不同的形式存在电泳时它们的迁移速率是( ) (a)OCDNA>SCDNA>LDNA (b)SCDNA>LDNA>OCDNA (c)LDNA>OCDNA>SCDNA (d)SCDNA>OCDNA>LDNA

  43. 3、pBR322是一种改造型的质粒，含有两个抗性基因，其中四环素抗性基因来自 ( ) (a)ColEl (b)Ri质粒 (c)pSCl01 (d)pUCl8 4、关于穿梭质粒载体，下面哪一种说法最正确?( ) (a)在不同的宿主中具有不同的复制机制 (b)在不同的宿主细胞中使用不同的复制起点 (c)在不同的宿主细胞中使用不同的复制酶 (d)在不同的宿主细胞中具有不同的复制速率

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