蛋白质的结晶 & 晶体数据收集

1. 蛋白质的结晶&晶体数据收集

2. 蛋白质结构解析基本流程 选择目的基因 在表达系统中插入DNA 在培养物中大量生产蛋白 合成DNA并连接标记 组织中提取蛋白 蛋白质结构 用亲和层析柱或其他方法纯化蛋白 NMR色谱仪 数据分析 蛋白质结晶 X光衍射

3. 晶体结构解析一般步骤 • 蛋白质晶体的培养和挑选 • X－射线照射晶体，得到衍射数据 • 根据晶体性质，分析衍射数据，获得晶体晶胞空间群。 • 解晶体结构要进一步知道晶胞中原子的分布也就是原子坐标。这就需要结合其他方法，获得衍射点的振幅、相角、电子密度等信息，最终得到晶体结构。 • 探讨结构和性质间的关系

4. 蛋白质的结晶

5. 蛋白质结晶原理 • 蛋白质在其溶液中的结晶其实是一种中缓慢沉淀的过程。 • 溶液中存在的作用力有疏水相互作用、静电力、氢键作用力等，当吸引力与排斥力达到平衡时溶液处于稳定状态。当吸引作用增大，或分散的或排斥的相互作用减小时，分子开始趋向与聚集状态。例如在液态环境中，如果生物大分子溶液很浓，没有足够的水维持其溶剂化作用，则分子可能聚集成非晶态沉淀，也可能结晶出来。

6. 蛋白质结晶过程 • 晶核形成：是结晶过程的关键 • 分子运动会引起密度起伏，即在某些区域，相邻链由于分子运动随机的产生一个微小的有序区域，即晶胚。而在另一瞬间晶胚可能随时被拆散。 • 在平衡溶液中，起伏也处于一种平衡态，而在过饱和的亚稳状态下，起伏总趋势朝促使新相形成，因此有些晶胚可能稳定的存在，并成为晶体生长的核心，即临界核。 • 晶体生长：晶核生成后，只要条件合适晶体就将继续长大。晶体生长速度及形态受环境因素影响。 导致大分子结晶的方法，是使体系非常缓慢地趋向溶解度最小，从而达到有限的过饱和度。这样可以防止晶核形成过多，并且可以控制晶体生长速度，以获得质量较好的单晶。

7. 常用的使蛋白质沉淀的方法是加入沉淀剂，这种方法是通过降低水的流动性来增加蛋白质的有效浓度。常用沉淀剂：聚乙二醇（PEG），盐（如硫酸铵）。常用的使蛋白质沉淀的方法是加入沉淀剂，这种方法是通过降低水的流动性来增加蛋白质的有效浓度。常用沉淀剂：聚乙二醇（PEG），盐（如硫酸铵）。 另外一种方法：减小蛋白质分子间的排斥力或是增大他们之间的吸引力。如加入有机溶剂，改变溶液的PH，温度等。 蛋白质结晶方法 • 蛋白质的溶解性与盐浓度或其它参数关系的典型曲线。最好的晶体应该是在低于成核时过饱和度的条件下生长出来的。

8. 蛋白质结晶条件 • 杂质、晶核及其他因素如温度、溶液PH值及振动等都会影响结晶过程。 • 为使蛋白质结晶，要求： • 蛋白质纯度足够高，不含其他化合物。 • 蛋白质分子表面性质相同，聚集形式均一。 • 蛋白质溶解在合适的溶剂中。 • 溶液达到过饱和，使蛋白质形成小的聚集体，作为晶体生长的晶核。晶核形成，晶体才开始生长。 • 溶液的过饱和度要降至最低水平，避免太多的晶核产生。 • 晶体生长尽量缓慢以便在结构中达到最大的有序度，方法：改变温度，蛋白质浓度等。

9. 蛋白质结晶步骤 • 样品准备－－纯化及检验 • 蛋白质初步结晶及优化 • 晶体！

10. Purification • Fundamental Purification Techniques ION-EXCHANGE GEL FILTRATION AFFINITY CHROMATOGRAPHY • Aim: Obtain high purity and homogenous protein sample

11. Purity & Homogenity • Purity Check SDS-PAGE • Homogenity Check Native PAGE, Dynamic Light Scattering(DLS) The DLS profile of a protein is highly predictive of its crystallizability. Proteins with monomodal distributions have a high probability (70-80%) of producing some kind of crystals.

12. Ion-exchange • Principle: Based on charge difference among different proteins • Characteristics No limitation to sample column Expeditious

13. Gel Filtration • Principle: According to differences in sizes • Characteristics Much limitation on sample volume Low velocity compare to ion-exchange

14. Affinity Chromatography Principle Biospecific ligand covalent attached to the matrix Characteristics Specific； High yield Fusion protein Fusions with oligo-Histidine Fusion with GST Fusion with Protein A ScFv fusions with E-tag Fusion with intein

15. 蛋白质初步结晶及优化 • 蛋白质结晶方法

16. 蛋白质结晶方法 • 整批结晶法 • 透析法 • 液液扩散法 • 气相扩散法

17. 蛋白质结晶方法 • 整批结晶法(batch crystallization) 这是最古老也是最简单的蛋白质结晶的方法。该方法的原理是瞬间将沉淀剂加入蛋白质溶液中，使溶液突然达到高度饱和状态。如果运气好的话，晶体会逐渐从过饱和溶液中析出并且不需要其他步骤。Chayen等(1990,1992)设计了一个自动化的微量整批结晶（microbatch crystallization）的系统。

18. 透析法（dialysis） 适用于对于大量蛋白质样品进行结晶。 微量透析法（liquid-liquid diffusion ） 图a和图b中，蛋白质溶液保留在毛细管中。图c中，蛋白质溶液被甩到管底并与膜接触。图d和图e中，毛细管置于盛有渗析液的Eppendorf管中。 蛋白质结晶方法

19. 液液扩散法 熔点毛细管中的液液扩散 图示为沉淀剂密度较大时 ——这种方法是在小孔毛细管中将蛋白质溶液与含有沉淀剂的溶液相互覆盖 ，让其自己缓慢扩散的过程。 ——蛋白质溶液与沉淀剂以 1:1混合。因此沉淀剂浓度 应为最终所需浓度的2倍。 蛋白质结晶方法

20. 蛋白质结晶方法 • 气相扩散法(vapor diffusion) • 悬滴法（hanging drop method） • 坐滴法（sitting drop method）

21. 悬滴法 使用带有空穴的盘子，蛋白质溶液的液滴悬挂在盖玻片的下方，盖玻片覆盖在密封有沉淀剂溶液的空穴上方。盖玻片的表面经过硅化处理以阻止液滴在玻璃表面的铺展。 这种方法是利用气相平衡的原理，使任何挥发性的组分在小液滴和大样品池间达到平衡，使蛋白质液滴中沉淀剂及蛋白质的浓度逐渐增加，达到过饱和状态，最终析出晶体 非常适用于只有少量样品，却要筛选大量条件的情况。 气相扩散法

22. 气相扩散法 • 坐滴法 • 如果蛋白质溶液表面张力低，在悬滴法中蛋白质溶液在盖玻片上铺展而不能形成液滴，此时可用坐滴法。

23. Protein Sample • Protein Concentration: 5-20mg/ml • Salt concentration: as low as possible. If the protein is not soluble, change the pH of the buffer or add small amounts of different salts. • Buffer concentration: 5-10mM, 10-20 times lower than the buffer concentration used in the well. (100mM in the first screen). • Stabilizer:DTT, EDTA and protease inhibitors. A typical protein buffer is 10mM TEA/HCl, pH7.5, 25mM NaCl, 1mM DTT, 1mM EDTA and 1mM NaN3.

24. 结 晶

25. Crystallization • The initial screen • PH；T；salt concentration； precipitant concentration Optimization Step No favorite conditions exist Add inhibitors, substrate analogues or additives to the protein drop, check and improve the purity and homogeneity of the protein and try a different initial screen.

26. 晶体

27. 现象及解释 Plate 18: Needles grown after seeding with one small needle. Plate 19: Hexagonal plates Plate 20: Crystals (polarizer used)

28. 接种 Plate 23: Macroseeding of RBP. All photographs are taken at the same magnification. (a) Small seeds of RBP, approximately 0.05mm in size, were placed in sitting drops. The crystals were observed at 24 hours(b) and 48 hours ( c) during which time they increased 1000-fold in total volume.

29. 现象及解释 (b) • Plate 26: 表面有时也是有欺骗性的. • (a) and (b) show PDGF crystals that diffract only to approximately 6A. • (c) shows crystals of glyoxalase I that diffract to 1.7A.

30. 晶体的x射线衍射 • X－ray是一种电磁波,直线传播、波长较短。结构分析中常用的波长在0.5~2.5Å • 同可见光被二维光栅衍射类似，晶体可以衍射x射线，只不过光栅是二维的而晶体是三维的。 • 衍射图案和光栅之间存在倒易关系：即光栅距离越大，衍射点距离就越近。 • 由二维网格衍射可产生按行排列的二维衍射图案，衍射图案是实际的电子网格的倒易。晶体可以被看作三维晶格，可以想象它将产生三维的X光衍射图案。衍射图案是晶体晶格的倒易。

31. 晶体的x射线衍射 • 衍射图： • 各种晶体晶胞大小存在差异，故不同晶体的衍射图案有所不同，又因为晶体的各向异性，不同角度照射晶体所得的衍射图案也有所不同。 • 因此我们可以对晶体的进行多角度x射线衍射以获得晶体的结构信息。

32. X光光源及探测器 • 收集X光衍射数据的主要硬件设备： • X光光源 • 单色器 • X光探测器

33. X光光源 • 密封X-射线管（sealed x-ray tubes） • 旋转阳极管（rotating anode tubes） • 同步辐射 ( Synchrotron Radiation)

34. 在密封X-射线管中，阴极发射电子，因为管子处于真空状态，相对于金属阳极，阴极有很高的负电势，电子被加速并以很高的速度到达阳极。阳极通常是铜板。在密封X-射线管中，阴极发射电子，因为管子处于真空状态，相对于金属阳极，阴极有很高的负电势，电子被加速并以很高的速度到达阳极。阳极通常是铜板。 电子能量的大部份转变成热量。一小部分能量以两种不同的X射线的形式发出来。 X光光源——密封X-射线管

35. 铜阳极靶的X-射线管的光谱。 平滑的连续区域是减速（或加速）的带电粒子发出的电磁辐射造成的。 锐锋则是由于电子在阳极物质的原子的内部轨道中发生跃迁时产生的高能电子轰击阳极原子，原子的低能级电子被轰击出来，而高能级电子占据空轨道，在这一过程中便释放出特定波长的X射线。 由于L－层的精细结构，Kα分裂为Kα1和Kα2两条谱线。M层的能级很靠近，因此Kβ只是一个单峰。 为了得到光谱中特定波长的谱线，需要一个最小激发电压 。 加大电压或者增大管电流可以增加衍射的强度。 局限性：在聚焦点处电子束对阳极所产生的致热作用限制了X射线管的最大功率。功率太大将毁坏射线管。 密封X-射线管——X射线产生原理

36. X光光源——旋转阳极管 • 与密封X-射线管类似，只是用可旋转的柱体代替固定的金属片。 • 比密封管的优点是它较高的辐射强度，伴随的缺点是必须连续的抽气以保持其所需的真空度。

37. 艺术家画的座落于Grenoble的欧洲同步辐射装置。艺术家画的座落于Grenoble的欧洲同步辐射装置。 周长是844.39米。 同步辐射器是一个庞大而且昂贵的装置。环的直径有10到几百米的大小。 X光光源——同步辐射

38. 同步辐射仪是以同步加速器为基础构建而成。 同步加速器是使带电粒子（负电子或正电子）以近光速回转的装置。粒子从线性加速器或辅助同步辐射装置直接注入储存环。 粒子在电场和磁场共同作用下运动。其的轨迹由它们的能量及使带电粒子改变方向的磁场决定。 当粒子束改变方向时，负电子或正电子便向环中心方向加速，释放出电磁辐射，进而释放能量。能量的损失由每次循环的射频输入来补偿。 由于自由运动的电子(和正电子) 是无法量子化的，依赖带电粒子的能量和磁场强度的不同，所产生的辐射的范围很广。 X光光源——同步辐射（原理）

39. 同步辐射的特性 • 高强度(intensity) • 仅用弯曲磁场它就能产生比普通X射线发生器高两个数量级的辐射，而用多极摇摆磁场或波纹磁场能产生更高数量级的辐射。非常适用于衍射能力弱的样品的数据收集。另一个优点是射线的低发散度，这导致清晰的衍射点。 • 可调性(tunability) • 同步辐射在可调性上也与X光发生管不同用单色器可以选取光谱范围内任何合适的波长。 • 偏振（polarization） • 来源于X光管的X射线是非偏振的，同步辐射则是高度偏振的。射线的偏振对原子的反常X射线散射有影响。

40. 用于从射线源所提供的光谱中选取一窄的波长带。用于从射线源所提供的光谱中选取一窄的波长带。 双型单色器。 改变波长的旋转轴A点垂直于页平面。旋转后引起出射光微小的垂直位移，出射光平行于入射光。 单色器

41. X光探测器 • 获得最终数据

42. 数据收集时考虑的参数 • 晶体到探测器的距离：晶胞越大该距离应加大，以免衍射点重叠。 • 分辨率：晶体衍射能力强则应收高分辨率数据，θ角大分辨率高但收高分辨率数据时必定会牺牲低分辨率数据质量。所以对一个新蛋白来说，也可先收一次中等分辨率的数据，以满足起始工作的要求。如用分子置换法，则最初用4A数据也可以了。多对同晶置换法跟踪肽链走向时有3A电子密度图也足够了。低分辨率电子密度图比高分辨率电子密度图连续性好，当然粘连也严重。

43. 徊摆角度：在不增加衍射点重叠条件下，徊摆角尽量大，这与晶胞大小有关。100A左右大约每幅画面1－2°徊摆角度：在不增加衍射点重叠条件下，徊摆角尽量大，这与晶胞大小有关。100A左右大约每幅画面1－2° • 曝光时间：取决于晶体衍射能力和晶体在X－射线下的寿命（或稳定性）。如果衍射能力弱，寿命又短，则要在这二者之间取得平衡，减少曝光时间可收集更多画面得到一套完整的数据，但衍射点强度相对弱，数据误差可能大一些。加长曝光时间可能要两颗晶体才能收集一套完整数据，则数据合并时也会加大数据的误差。

44. DENZO －指标化工作 可获得： 晶体的格子类型，晶胞参数， 晶体取向参数信息。 批量处理 scalepack－整合 获得空间群 将数据整合为一个文件 数据初步处理 .pck files Xdisp/denzo .x files scalepack .sca file • 数据质量评价 • 完整度（completeness）；丰度（redundancy）；Rmerge

45. 结构解析 • 选用不同的方法（分子置换，反常散射，直接法），获得相位，进而得到最终结构。

46. Thanks!