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手足口病的实验诊断. 安徽省疾病预防控制中心 2009 . 3 . 11. 手足口病的病原. 手足口病（ hand-foot-mouth disease, HFMD ）由人肠道病毒感染引起。 人肠道病毒为小 RNA 病毒科（ Picornaviridae ），肠道病毒属（ Enterovirus ）的一组单股正链 RNA 病毒。其中包括埃可病毒（ 31 个血清型）、柯萨奇病毒 A 组（ 23 个血清型）和 B 组（ 5 个血清型），还包括 3 个脊髓灰质炎病毒血清型和人肠道病毒 68-71 型。. 人肠道病毒的毒粒结构. ~ 30nm 二十面体对称 无包膜.
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手足口病的实验诊断 安徽省疾病预防控制中心 2009 . 3. 11
手足口病的病原 • 手足口病（hand-foot-mouth disease, HFMD）由人肠道病毒感染引起。 • 人肠道病毒为小RNA病毒科（Picornaviridae），肠道病毒属（Enterovirus）的一组单股正链RNA病毒。其中包括埃可病毒（31个血清型）、柯萨奇病毒A组（23个血清型）和B组（5个血清型），还包括3个脊髓灰质炎病毒血清型和人肠道病毒68-71型。
人肠道病毒的毒粒结构 • ~30nm • 二十面体对称 • 无包膜 Courtesy of Linda M. Stannard, University of Cape Town, S.A.h
人肠道病毒发现的历史 • 脊髓灰质炎病毒：1909年首次鉴定出该病毒，1949年，利用细胞培养的方法增殖病毒，为疫苗的研制奠定了基础。 • 柯萨奇病毒：1948年在美国纽约Coxsackie镇，将两名麻痹患儿的标本接种至乳鼠体内，分离出来的一组病毒定名为柯萨奇病毒。根据它们在乳鼠上产生的组织病理学变化和在细胞培养上的能力，分为柯萨奇病毒A组和B组。 • 埃可病毒：1951年在一名无症状的儿童的粪便标本中分离到，在细胞培养上可以造成致细胞病变，但对乳鼠和灵长类动物不致病。 • 新肠道病毒：随后新发现的病毒被按照序号命名（69~71），最近，已经命名至102型
手足口病的常见致病病原 多种肠道病毒都可引起HFMD，主要为： • 柯萨奇病毒A组的4～7、9、10、16型 • B组的1～3、5型 • 埃可病毒的部分血清型 • 肠道病毒71型 最常见的为CV-A16和EV71
肠道病毒的抵抗力 • 肠道病毒无包膜，乙醚、75%酒精、表面活性剂等均不能将其灭活。 • 对紫外线及干燥敏感；各种氧化剂（高锰酸钾、漂白粉等）、甲醛或56℃ 30min都能灭活病毒 • 病毒在4℃可存活1年，-20℃可长期保持感染性 • 病毒RNA有感染性。
手足口病的标本采集 （一）粪便标本 采集病人发病7日内的粪便标本，用于病原检测。粪便标本采集量5～8g/份，采集后立即放入无菌采便管内，4℃暂存立即(12h内)送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。 （二）脑脊液标本 出现神经系统症状的病例，要采集脑脊液标本，进行病原和抗体检测。采集时间为出现神经系统症状后3日内，采集量为1.0～2.0ml。采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中，4℃暂存立即(12h内)送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。
手足口病的标本采集 （三）血清标本 采集急性期(发病0～5天)和恢复期(发病14～30天)双份配对血清用于抗体检测。检测IgM时，采集 (发病7～20天)血。静脉采集3～5ml全血，置于真空无菌采血管中，自凝后，分离血清，将血清置于－20℃以下冰箱中冷冻保存。 （四）咽拭子标本 采集病人发病3日内的咽拭子标本，用于病原检测。用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有3～5ml保存液（细胞维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，4℃暂存立即(12h内)送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。
手足口病的标本采集 （五）疱疹液 可同时采集多个疱疹作为一份标本，用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有3～5ml保存液（维持液或生理盐水）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封。所采集标本4℃暂存立即(12h内)送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。
标本采集器械要求 • 注射器：医用（5ml和10ml）一次性注射器 • 棉拭子：塑料杆 • 全血收集管：10ml螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈) • 血清保存管：2 ml螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈)，可耐深低温（液氮保存） • 粪便保存管：5-20 ml螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈)，可耐深低温（液氮保存）-全国POLIO网络实验室
标本采集器械要求 病人标本的采集运输和保藏 • 鼻咽拭子保存管：10 ml螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈)，可耐深低温（液氮保存） • 痰液保存管：50 ml螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈)，可耐深低温（液氮保存） • 尸检组织冻存管：50ml螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈)；尸检（每一个样品换手术刀） • 记号笔：油性，防水
标本采集注意事项 在手足口病的实验室诊断中，从疱疹液或脑脊液 中分离病毒具有很高的诊断价值。 用于采集咽拭子的无菌拭子要放在适当的保存液中，如维持液或生理盐水，以防干燥。
标本采集注意事项 • 为了保证检测结果的准确性和有效性，标本应在病例发病后尽早采集，尽快检测。 • 不能立即检测的标本应冷冻保存。 • 对于血清学诊断，急性期血清应该在发病后尽早采集，恢复期血清在发病2-4周后采集。
手足口病的实验室诊断 手足口病的诊断一般是通过采集适当的临床标本后进行基因检测、抗原检测、血清学抗体检测、病毒分离和病鉴定
手足口病的实验室诊断方法 • 病毒分离 • 抗体检测 • 核酸检测 • 蛋白/核酸芯片
标本 测双份血清 中和抗体滴度 RT-PCR Real time RT-PCR 检测病毒核酸 序列测定 病毒分离 CPE阳性 无CPE 中和定型 RT-PCR 及序列测定 常规实验 补充实验 非肠道病毒 肠道病毒 手足口病的实验室检测流程
病毒分离培养 • 用于病毒分离的标本： 包括粪便、咽拭子和疱疹液，如果患者出现神经系统症状，可以采集脑脊液标本 • 适用的细胞 RD细胞（人胚胎横纹肌肉瘤细胞）、Hep-2细胞（人喉上皮癌细胞）
病毒分离培养 • 标本的处理 1、粪便：2g 加PBS 10ml，振荡混匀，1500g低温离心20min，上清0.2ml接种敏感细胞 2、咽拭子：于采样管中充分洗涤拭子， 4℃下 10000rpm离心20min，上清0.2ml接种敏感细胞 3、脑脊液和疱疹液：直接接种
病毒分离培养 • 培养观察： 36℃培养逐日观察，第1代培养见可疑CPE 至观察满7天后再继续冻融传代，待稳定CPE出现后, - 20℃或- 70℃冻存以备进一步鉴定； 如果7天之后没有出现CPE，需盲传2代继续观察，盲传2代后仍不出现CPE则判定为阴性； • 鉴定：中和试验
血清抗体检测 • 方法 中和实验、 ELISA • IgM：单份血：急性期 • IgG ：双份血：急性期，恢复期 • 阴转阳，四倍升高，四倍降低均可诊断近期感染
病毒核酸检测—RT-PCR RT-PCR(Reverse Transcriptase PCR) • 用于RNA病毒的检测，酶促催化使RNA逆转录成cDNA第一链，逆转录与第一次PCR在同一系统内进行，逆转录完成后，加热灭活逆转录酶，然后开始PCR扩增。一条寡聚脱氧核苷酸引物先与mRNA杂交，然后由依赖RNA的DNA聚合酶催化合成相应互补的cDNA拷贝，后者能进一步用于PCR扩增。
病毒核酸检测—RT-PCR 方法特点： • 快捷、简便 • 高度灵敏、特异 • 具有病原诊断意义 • 高效的通用型技术平台
标本的预处理 粪便标本：采用氯仿进行处理。 肛拭子/咽拭子标本：咽拭子要在标本保存液中充分搅动，然后在4℃下，10000 rpm离心20min 。 疱疹液和脑脊液：直接用于RNA提取。
RNA的提取 可使用商业化试剂盒从临床标本中提取病毒RNA 简化操作、规范方法、条件一致、排除干扰 QIAGEN Viral RNA Mini Extraction Kit（CAT：52904）适合临床标本和病毒培养物标本 QIAGEN Rneasy Mini Kit（CAT： 74104） 适合组织和咽拭子标本
引 物 • 人肠道病毒（包括EV71、CA16、CA24v、EV70）核酸检测通用引物 PE2（上游）：5`- TCC GGC CCC TGA ATG CGG CTA ATC C -3` PE1（下游）：5`- ACA CGG ACA CCC AAA GTA GTC GGT CC -3`
引 物 EV71核酸检测引物序列： EV71-S（上游）：5`-GCA GCC CAA AAG AAC TTC AC -3` EV71-A（下游）：5`-ATT TCA GCA GCT TGG AGT GC -3`
引 物 CA16核酸检测引物序列： Cox A16-S（上游）：5`-ATT GGT GCT CCC ACT ACA GC-3` Cox A16-A（下游）；5`-TCA GTG TTG GCA GCT GTA GG-3`
反应体系 根据自己实验室的实际情况建立各自RT-PCR反应体系 配下列试剂主溶液： 10×PCR Buffer（含Mg2+）·················································5.0μl dNTPs（2.5mM each）······················································· 2.0μl 上游引物（0.1μg/μl）························································1.0μl 下游引物（0.1μg/μl）························································1.0μl RNA酶抑制剂（RNasin,40U/μl）······································ 0.5μl Taq DNA聚合酶（5U/μl）················································· 0.5μl AMV逆转录酶（10U/μl）·················································· 1.0μl 模板RNA·········································································· 3.0μl RNase Free dH2O··························································· 36.0μl 50.0μl
温度循环参数 在PCR仪上进行RT-PCR反应，反应步骤如下： 42℃························45min 95℃························3min 95℃························20s 50℃························25s ×32个循环 72℃························30s 72℃························10min 4℃························Soak
结果解释 通过比较标本的PCR产物与阳性对照的PCR产物在凝胶上的位置以及大小来解释结果。
实验室诊断原则 • 人肠道病毒在自然界广泛存在且种类繁多，一病多原、一原多症是肠道病毒感染的重要特征。因而应对血清诊断及病原诊断的实验室结果作严格评价，必须结合临床症状及环境因素流行病学分析，以确立病毒与疾病的病原学关系。 • 一般采取的原则为： • （1）病毒分离阳性率远高于对照人群； • （2）病程中有特异性抗体变化并排除其他病毒感染； • （3）从病变组织中分离出病毒。
实验结果的诊断意义 从疑为肠道病毒感染的脑炎/脑膜炎患者的脑脊液中检测到相应的肠道病毒核酸（RT-PCR法），或分离到病毒或肠道病毒IgM阳性，即可证明是该肠道病毒引起的中枢神经系统感染。 从疑为死于EV71（或其它肠道病毒）的尸检标本中检测到相应的肠道病毒核酸，或分离到病毒或肠道病毒IgM阳性，即可证明是该肠道病毒是病因。 从HFMD患者的疱疹液中检测到相应的肠道病毒核酸，或分离到病毒，那么该病毒就是病因病原。
实验结果的诊断意义 当无法进行病毒分离或未分离到病毒时，血清学诊断方法可以作为病毒感染的间接证据。肠道病毒有时引起无症状感染，只从个别HFMD患者粪便标本中分离到EV71（或其它肠道病毒）时，不能轻易下结论EV71是病因，应该扩大样本量，所以实验结果的实际意义应结合临床过程和流行病学资料进行解释。
手足口病检测实验室相关问题 1、实验室生物安全问题：必须重视的问题 • 实验人员受过生物安全培训 ① 有防范潜在生物危害的意识 ② 熟悉生物安全规程，掌握生物安全技能 • 实验室自己的生物安全指南 • 合格的生物安全实验室 • 实验室文件化的规程及方法（包括常规的和特殊的）
手足口病检测实验室相关问题 2、PCR实验室质量控制问题： 保证实验结果可靠的必要手段 • 实验对照：阳性、阴性、试剂、空白对照 • 控制实验室核酸污染 ⑴ 试剂污染 ⑵ 器械污染 ⑶ 实验过程污染
手足口病检测实验室相关问题 3、实验结果的应用问题： 综合分析、排除干扰、合理运用 ⑴ 阳性结果：排除假阳性干扰 分析阳性结果的价值 ⑵ 阴性结果：分析可能的原因（样品采集？过程规范？核酸降解？试剂质量？临床信息误导？）
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