ΕΘΝΙΚΟΝ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟΝ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ

1. ΕΘΝΙΚΟΝ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟΝ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Διπλωματική εργασία Μαλλούρη Βίκη Α.Μ 220168 ΜΟΡΙΑΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΚΛΗΡΟΝΟΜΙΚΗΣ ΠΑΡΑΜΟΝΗΣ ΤΗΣ ΕΜΒΡΥΙΚΗΣ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΗΣ ΣΤΗΝ ΕΛΛΑΔΑ Επιβλέπουσες: Ι. Σ. Παπασιδέρη, Αναπλ. Καθηγήτρια Παν. Αθηνών, Τμήμα Βιολογίας Φ.Καράμπαμπα, Μονάδα Μεσογειακής Αναιμίας Περιφερειακό Γενικό Νοσοκομείο Αθηνών ‘Λαϊκό’

2. Δομή της παρουσίασης • Περιπτώσεις με αυξημένη Ηb F, μεταλλαγές του Αγ γονιδίου (-117 Αγ,4bp) • Αναφορά στις μεθόδους • Συζήτηση για τις δυο μεταλλαγέςκαι την συμβολή τους στο φαινότυπο.

3. Το μόριο και η λειτουργία της αιμοσφαιρίνης Διαταραχές στη δομή της αιμοσφαιρίνης ή την σύνθεσή της οδηγούν σε αιμοσφαιρινοπάθειες

4. Mεσογειακή αναιμία • Aσθένεια στην οποία υπάρχει γενετικά καθορισμένη έλλειψη ή απουσία σύνθεσης μιας από τις αλυσίδες της αιμοσφαιρίνης. • Η πρώτη σε συχνότητα κληρονομική νόσος στην Ελλάδα. • 8% τα ετερόζυγα άτομα για β Μ.Α • Ετερογενής κατανομή (5-20%)

5. Τα αιμοσφαιρινικά γονίδια

6. Oι αιμοσφαιρίνες εκφράζονται σε διαφορετικό χρόνο και από διαφορετικό ιστό  Μεταστροφή Ηb Gower I ζ2ε2 HbGower II α2ε2 Hb Portlandζ2γ2 Hb Fα2Αγ, α2Gγ Hb Aα2β2 Ηb A2 α2δ2

7. Κατά την γέννηση η HbF αποτελεί το 60-80%. • Σταδιακή μείωση μέχρι το 0,5-1%. • F-κύτταρα • Φυσιολογικός ενήλικας Hb A:96-98% Hb A2:2-3% Hb F< 1%

8. Περιπτώσεις με αυξημένη Hb F Hb F>3% • Eρυθροποιητικό στρες • δβ-θαλασσαιμία • ΗPFH

9. δβ- θαλασσαιμία • Έλλειψη που περιλαμβάνει το β και δ γονίδιο • Ομόζυγη κατάσταση:100% ΗbF • Ετερόζυγη κατάσταση: 5-20% HbF (ετεροκυτταρική κατανομή) • Στον ελληνικό πληθυσμό απαντάται η δβsic και δβturk

10. Κληρονομική παραμονή της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνηςΗereditary Persistance of Fetal Hemoglobin Καταστάσεις κατά τις οποίες η έκφραση των εμβρυϊκών γονιδίων Gγ και Αγ διατηρείται σε υψηλά επίπεδα και στην ενήλικο ζωή,με αποτέλεσμα το ποσοστό της Ηb F να υπερβαίνει το 1% και να κυμαίνεται μεταξύ 10-50%. • Ελλειπτικού τύπου • Μη ελλειπτικού τύπου Μεταλλαγές που αφορούν στην οικογένεια των β γονιδίων Gγβ+ Αγβ+ Μεταλλαγές που αφορούν άλλες χρωμοσωμικές θέσεις

11. HPFH Ελλειπτικού τύπού • Εκτεταμένες ελλείψεις τμημάτων DNA που περιλαμβάνουν τα δ και β γονίδια αλλά και ρυθμιστικές περιοχές του συμπλέγματος των β γονιδίων • Eπίπεδα Ηb F 16%-30% • Αφαίρεση συγκεκριμένων τμημάτων DNA φέρνει σε γειτονία τα γ γονίδια με κάποιους ενισχυτές ή τα απομακρύνει από αλληλουχίες silencers.

12. Μη Ελλειπτικού τύπου • Σημειακές μεταλλαγές ή μικρές ελλείψεις στην περιοχή των υποκινητών των δυο γ γονιδίων. • Μικρότερα ποσοστά HbF σε σχέση με τις ελλειπτικού τύπου HPFH. • Μεταβάλλουν την συγγένεια πρόσδεσης ερυθροειδίκών ή μη ρυθμιστικών πρωτεϊνων.

13. Ημεταλλαγή -117 ΑγGA • Αντικατάσταση γουανίνης από αδενίνη στην θέση -117 του υποκινητή του Αγ γονιδίου • Συχνά ονομάζεται ελληνικού τύπου ΗPFH • H συχνότερη μεταλλαγή HPFH μη ελλειπτικού τύπου στην Ελλάδα • Εμποδίζει την πρόσδεση παραγόντων με κατασταλτική δράση στα γ γονίδια.

14. Η έλλειψη 4bp (Αγ -225 έως -222) • Mη ελλειπτικού τύπου • Έλλειψη τεσσάρων βάσεων (AGCA) • Εμφανίζεται σε μια μικρή περιοχή επανάληψης της τριπλέτας GCA

15. Σκοπός της εργασίας • Η ανίχνευση των συχνότερων μεταλλαγών στο Αγ γονίδιο (-4bp,-117 GA) σε ενήλικα άτομα στον ελληνικό πληθυσμό που παρουσίαζαν αυξημένη Hb F και η συμβολή τους στα αυξημένα επίπεδα της. H μελέτη της ΗPFH και γενικότερα των μεταλλαγών στα γ γονίδια συμβάλει στην κατανόηση των μοριακών μηχανισμών, που ενέχονται στη μεταστροφή της έκφρασης των εμβρυϊκών και ενήλικων γονιδίων του ανθρώπου,εφόσον αυτή αποτελεί θεραπευτική προσέγγιση για την Μ.Α.

16. Δείγματα • Μελετήθηκαν 47 δείγματα • Ενήλικα άτομα τα οποία χαρακτηρίζονταν από αυξημένα επίπεδα HbF και φυσιολογικούς τους λοιπούς αιματολογικούς δείκτες • Ενήλικα άτομα πάσχοντες από β-μεσογειακή αναιμία με σκοπό την πλήρη γονοτυπική ανάλυση στο Αγ γονίδιο.

17. Μοριακές τεχνικές που χρησιμοποιήθηκαν • Απομόνωση DNA από λευκοκύτταρα περιφερειακού αίματος • Ενίσχυση συγκεκριμένης αλληλουχίας του Αγ υποκινητή με Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης-PCR • Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης • Ηλεκτροφόρηση σε ακρυλαμίδη με κλίση αποδιατακτικών παραγόντων-DGGE • Πέψη με περιοριστικές ενδονουκλεάσες

18. Έλεγχος ποιότητας του DNA Τα δείγματα επιλέχθηκαν μετά από ηλεκτροφόρησή τους σε πήκτωμα αγαρόζης Θέση 4 ΦΧ-174

19. Αποτελέσματα PCR Hλεκτροφόρηση προιόντος PCR, FAG Αγ μεγέθους 681bp Hλεκτροφόρηση προιόντος PCR, ΗPFAGAγμεγέθους 327bp

20. Αποτελέσματα Από εφαρμογή της DGGE→ στον υποκινητή του Αγ: -117 Αγ Νl (μάρτυρας) Mάρτυρας -117Αγ/4bp Mάρτυρας -117Αγ/Νl Mάρτυρας 4bp/Νl -117 Αγ /Νl Nl/Nl Nl/Nl Nl/Nl Nl/Nl Nl/Nl Nl/Nl Nl/Nl Nl/Nl Nl/Nl 4bp/Νl 4bp/Νl

21. θέση αναγνώρισης του MseI 37 bp 290 bp Φυσιολογικό γονίδιο: Γονίδιο με τη μεταλλαγή –117 GAAγ: 181 bp 109 bp Γονίδιο με την έλλειψη 4 bp: HPFAG 327 bp Προϊόν PCR: Πέψη με περιοριστικές ενδονουκλεάσες Πέψη με το ένζυμο MseI

22. Πέψη με περιοριστικές ενδονουκλεάσες Πέψη με το ένζυμο Fnu4HI 173 bp 112 bp 42 bp Φυσιολογικό γονίδιο: Μεταλλαγμένο γονίδιο: 211 bp 112 bp HPFAG 327 bp Προϊόν PCR: 4bp/4bp ΦΧ-174 Nl/Nl Nl/Nl Nl/Nl Nl/Nl 4bp/Nl 4bp/Nl 4bp/Nl 4bp/Nl 4bp/Nl 4bp/Nl 4bp/Nl 4bp/Nl 4bp/Nl 4bp/Nl 4bp/Nl

23. Oμάδες δειγμάτων • Φυσιολογικά και απλά ετερόζυγα άτομα για β μεταλλαγή • Άτομα με ενδιάμεση Μ.Α (ομόζυγα και διπλά ετερόζυγα για β μεταλλαγές) • Πάσχοντες με Μ.Α

24. Ανίχνευση της μεταλλαγής -117 Αγ GA σε φυσιολογικό άτομο

25. Ανίχνευση της 4bp μεταλλαγής σε άτομα με ενδιάμεση Μ.Α

26. Ανίχνευση της 4bp μεταλλαγής σε ετερόζυγα άτομα για το β γονίδιο

27. Ανίχνευση της 4bp μεταλλαγής σε πάσχοντες από μείζων Μ.Α

28. Δείγματα στα οποία δεν ανιχνεύθηκε γνωστή μεταλλαγή

29. Συμπεράσματα • Η μεταλλαγή -117 Αγ βρέθηκε σε ένα μόνο άτομο με φυσιολογικό αιματολογικό φαινότυπο και αυξημένη F όπως άλλωστε αναμένεται. • Σε καμία περίπτωση πασχόντων από ενδιάμεση ΜΑ δεν αποδείχθηκε ότι η αυξημένη ΗbF την οποία παρουσίαζαν οφειλόταν στην μεταλλαγή –117 Αγ. • Μια πιθανή συμβολή της 4bp στην αύξηση της ΗbF θα σχετίζεται με δευτερεύοντες μηχανισμούς και με συγκεκριμένους απλότυπους ενώ δρα κύρια ως πολυμορφισμός.

30. Ευχαριστίες • Ι. Σ. Παπασιδέρη , Aναπλ. Καθηγήτρια Τομέα Βιολογίας Κυττάρου και Βιοφυσικής • Δρ. Φωτεινή Καράμπαμπα, εργαστήριο Προγεννητικής Διάγνωσης του μονάδας Μεσογειακής Αναιμίας. • Δρ. Αφροδίτη Λουτράδη-Αναγνώστου,Διευθύντρια της μονάδας Μεσογειακής Αναιμίας του Π.Γ.Ν Αθηνών «Λαϊκό» • Το επιστημονικό και τεχνολογικό προσωπικό του εργαστηρίου (Δρ. Μ. Μπουσίου, Δρ. Κ. Σινοπούλου, κ.Ε.Λάλου κ. Π. Μελίστα, κ. Ζ. Μουζάκη, κ. Ν. Σακελαρίου, κ. Γ. Τσίτσου, κ.Δ.Πίπη)

31. Ευχαριστώ για την προσοχή σας!