Entrée des bactéries et interactions avec le cytosquelette

1. Entrée des bactéries et interactions avec le cytosquelette

2. Entrée des bactéries et interactions avec le cytosquelette Bactéries pathogènes Extracellulaires Intracellulaires Entrée type zipper type trigger Multiplication intracellulaire Vacuole cytosol toxines Passage cellule - cellule

3. Salmonella • Espèce: Salmonella enterica • 9 sous-espèces • 2500 sérotypes • Salmonellose: • Fièvres typhoides • Gastroentérites

4. Listéria • Bactéries opportunistes • Contamination: chaînes des aliments • Listériose: • Mots de tête, des méningites, risques d’avortement chez la femme enceinte

5. Shigella • Entérobactéries proches des E. coli • exclusivement humains • 4 espèces dont: • Shigella dysenrereria (dysenterie bacillaire)

6. Yersinia • Entérotoxinogènes • Y. enterocolitica et Y. pseudotuberculosis: gastroentérites • Y. pestis: peste pneumonique et bubonique

7. Escherichia coli • Pas toutes entéropathogènes • EIEC : virulence comme Shigella • ETEC: « Turista »: • sécrétion de toxines

8. Mécanisme d’invasion • Composition de la flore: résistance à la compétition entre bactéries de l’intestin et des conditions de l’intestin • Substances microbicides: défensines, mucus,… • Facteurs mécaniques: desquamation, péristaltisme intestinal,… • Passage de la barrière cellulaire • Résistance à la réponse immunitaire (PAM, IgA, cellules)…

9. Stratégies de translocation de l’intestin • Cellules M • Pôle apical • Pôle baso-latéral • Transcytose des entérocytes • Capture par les phagocytes

10. Stratégies de translocation de l’intestin Listeria Cossart and Sansonetti, Science 2004

11. Entrée • Mécanisme actif • Cellules non-phagocytaires : La bactérie « force » la cellule à l’internaliser • Cellules phagocytaires : La cellule « ingère de force » la bactérie • Mécanisme de survie • à l’abri de la RI • présence de nutriments

12. Mécanisme d’entrée • Adhésion à la surface cellulaire • Rapprochement bactérie-cellule • Accés à d’autres composants • Induction d’un signal d’internalisation • Internalisation • Mécanisme de Type « Zipper »faible perturbation membranaire • Mécanisme de Type « Trigger »forte perturbation membranaire

13. Molécules impliquées

14. Entrée type trigger : Salmonella Notion d’îlot de pathogénicité : Acquisition par transfert horizontal. Une bactérie peut en contenir plusieurs SPI-1, SPI-5 = entrée SPI-2, SPI-3, SPI-4 = survie intracellulaire

15. TypeIII secretion system-invasome SPI-1 : SipA, SipB, SipC, SptP, IagB, AvrA SPI-5 : SopB SopE, SopE2, Appareil de sécrétion de type III : Système complet, inductible pour injecter des protéines qui sont capables de moduler la réponse de l’hôte (cytosquelette).

16. Sécrétion des protéines du T3SS-1 • Les effecteurs sont stockés en présence de chaperons dans la bactérie • Phase exponentielle : assemblage du T3SS sans sécrétion • Contact cellulaire : secrétions des protéines dans cytosol de la cellule (ATP) • IpaB – récepteur ac. Hyaluronique (CD44) • rôle du cholesterol (salmonelle) • Membranes ruffles : actine • Retour à la normale : dépolymérisation de l’actine

17. Régulation du cytosquelettecellulaire Régulation par des cascades de phosphorylation : Dans la forme de la cellule, la différentiation, l’embryogenèse, la division…

18. Régulation du cytosquelettecellulaire L’actine est régulée par- Des Rho GTPases (RhoA, Cdc42, Rac1) - Complexe Arp2/3

19. Régulation du cytosquelette d’actine

20. Injection • SopE (GEF): Activation de Rac, Cdc42 • SopB-SopE: Formation du complexeArp2/3 • Nucléation de l’actin:SipC, • Stabilisation filaments:SipA, • Membrane ruffles • Entrée de Salmonella • SptP : dépolymarisation

21. Expression de SopE dans les cellules Microinjection de SopE et de SptP dans les cellules Action antagoniste de SopE et de SptP

22. Comment Salmonella peut controler l’action de deux protéines antagonistes ? • Injection à différent temps • Injection en même temps, mais régulation de leurs stabilités

23. Cells start to look normal and SptP is degraded by the proteosome SptP GAP activity deactivates Cdc42 and Rac, restablizing the cytoskeleton SopE directs cytoskeletal rearrangements and is then degraded by the proteosome SopE and SptP are translocated via the T3SS

24. Entrée type zipper • Interaction avec les récepteurs, • Clustering signal intracellulaire, • Extension membranaire, • formation d’une vacuole, invagination.

25. Mécanisme d’entrée de Yersinia • Invasine • Récepteur: intégrines Béta 1 • Cascade de signalisation

26. Inhibition de la phagocytose: Régulation du cytosquelette d’actine

27. 10µm Yop E empêche le recrutement d‘actine induit par invasine Contrôle Yop E-Yersinia Yop E-Yersinia Actine Actine Contrast de phase

28. Yop T empêche le recrutement d‘actine induit par invasine Actine FITC-dextran 10µm

29. Entrée type zipper : Listeria monocytogenes

30. La famille des internalines • InlA • N ter = 15LRR (leucine rich repeat  hélice béta) : impliqué dans l’adhésion ou l’interaction récepteur-ligand • C ter = Leu-Pro-X-Thr-Gly (LPXTG) : liaison covalente avec le peptidoglycane par la Sortase A (41p) • InlB • Nter = 8 LRR • Cter = pas de LPXTG, pas de domaine hydrophobe tandem de 80 acA (GW-) ligand de l’ac. lipoteichoique

31. Entrée InlB – récepteur de l’hepatocyte growth factor (cMet) • Interaction InlB – glycosaminoglycanes • Extraction de la membr. de InlB? • Rôle du gC1qR ? • Interaction InlB soluble – cMet • GAG stabilise la liaison à cMet? • Phosphorylations de cMet  • Activation de Cdc42/Rac  Arp2/3  actin ?

32. Entrée InlA - Ecadhérine • Dimères E cadhérine  jonctions adhérentesInternalisation lors de la prolifération • Interaction LRR-domaine extrac. E cadhérine (proline 16) • Modification de la phosphorylation des  et  Caténines • Modification de la polymerisation de l’actineModification de Myosine VII et Vezatine  internalisation • rôle de Rac1, Cdc42, Arp2/3

33. Passage cellule - cellule

34. Mouvement intracellulaire (10-15µm/min.),- Formation d’une protrusion,- Echappement dans le cytosol.- Formation de plages de lyse

35. Queue d’actine et pathogènes • Bactéries cytosoliques • Listeria monocytogenes • Shigella flexnerii • Rickettsia • Burkholderia pseudomallei • Mycobacterium marinum • Virus • Vaccinia virus

36. Mobilité intracellulaire des Listeria : ActA • ActA (639 ac.a) est nécessaire à la mobilité dans le cytosol • ActA est suffisant pour la mobilité de billes de latex en milieu d’extrait cellulaire • ActA est polarisé à la membrane bactérienne Un mutant ActA - s’échappe de la vacuole, - pousse sous forme de microcolonies, - pas de plage de lyse

37. Rôle des domaines de ActA • N-terminus binds monomeric actin (discontinuous tail formation) and stimulates Arp2/3 nucleation activity (filament elongation) • KKRKK sequence functions like WASP-binds Arp2/3 • KKRKK mutants have ActA-null phenotype • Also has WASP-like acidic region • Proline-rich domain binds Ena/VASP (which binds profilin and F-actin_ • ActA amino-terminal domain (aa 30-263) is essential for actin polymerization in cytosol, and is sufficient if anchored to particle • ActA 30-263 does not directly interact with actin; Arp2/3 is required • Rho GTPase independent

38. Actin, Arp2/3, capping protein (cp), ADF/cofilin, et profilin sont suffisant pour former des queues d’actine en milieu extracellulaire et permettre le mouvement des Listeria in vitro Nature (1999) 401: 542

39. Escherichia coli

40. E. Coli enteropathogène EPEC EPEC = E. coli responsable de la diarrhées du nouveau né Perte des villosités, formation d’un piédestal

41. E. Coli enteropathogène EPEC • Attachement via flagelle et pili de type IV

42. Attaching and effacing E. coli EPEC • Attachement via flagelle et pili de type IV • Rôle majeur du LEE (chromosomique) • 35.5kb, 41 gènes = T3SS EPEC EHEC

43. Mécanismes d’action du LEE • Injection de EspB, D • Formation du translocon • Injection par le T3SS des EspG, F • Apoptose des mitochondries • Modification des cytokératines cellulaires • Injection de Map • Activation de Cdc42 • Destruction des jonctions serrées • Injection de Tir • Expression de Tir à la membrane • Contact Tir-intimin • Phosphorylation de Tir • Recrutement de Nck →Cdc42 → N-Wasp→Arp2/3 → actin

44. Conclusion • Dialogue moléculaire entre la bactérie et la cellule • Interaction bactérie-cellule = vue réductionniste • Prendre en compte la réponse de l’hôte (immunité, physiologie, génétique) • Rôle des autres bactéries de l’intestin (commensales, pathogènes) • Compréhension de la biologie cellulaire • Développement de vaccins vivants atténués