1 / 27

4. CENTRIFUGACE

4. CENTRIFUGACE. Podmínka dělení: l ≥ 1  suspenze  emulze  koloidní roztoky (NK, bílkoviny). Rychlost sedimentující částice v. Frikční koeficient Stokesův zákon. Relativní odstředivé zrychlení R – násobek g. N = r.p.m.

tuyet
Download Presentation

4. CENTRIFUGACE

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. 4. CENTRIFUGACE Podmínka dělení: l ≥ 1suspenze emulze koloidní roztoky (NK, bílkoviny)

  2. Rychlost sedimentující částice v Frikční koeficient Stokesův zákon Relativní odstředivé zrychlení R– násobek g N = r.p.m. sedimentační koef.s[sec] x sedimentační konst. →Extrapolace na C0 →20o C →H2O

  3. Svedbergova jednotka1S=1x10-13 sec

  4. 4.1. METODY4.1.1.DIFERENCIÁLNÍ CENTRIFUGACEmetoda pohyblivého rozhraní Dělení podle S Podmínka : ΔS max.; Smax na dno (≈ t, N) • Výhody: • Jednoduché • Nevýhody: • Pouze 1 složka • STĚNOVÝ EFEKT – • nedokonalé dělení

  5. 4.1.2. CENTRIFUGACE V KONCENTRAČNÍM GRADIENTUZONÁLNÍ Gradient • Kontinuální • Diskontinuální • Sacharosa • Dextran • FICOL ρ≥ 1,3 g/cm3

  6. 4.1.2. ZONÁLNÍ CENTRIFUGACEa. RYCHLOSTNÍb. IZOPYKNICKÁc. IZOPYKNICKÁ ROVNOVÁŽNÁ-automatické vytváření gradientu ( CsCl ρ≤1,9; F3AcOCs ρ≤2,6 g/cm3 ) Výhody • Dokonalejší dělení Nevýhody • Malé množství • Separace zón obtížná (propíchnutí) • Stěnový efekt IZOPYKNICKÁ RYCHLOSTNÍ ρ> ρč ρ ρ< ρč S ≈ r2

  7. Centrifugační zkumavky • Skleněné • Z umělé hmoty: • Ependorfky • Zkumavky s víčkem • QUICK – SEAL polyallomer tubes

  8. 4.2. TYPY ODSTŘEDIVEK

  9. 4.2.1. DISKONTINUÁLNÍ ODSTŘEDIVKY s výměnným rotorem a. Se závěsnými kyvetami α = 90o V = 30 ml – 3 l, N = 3 – 10 000 S úhlovým rotorem b.α = 14 -40oc.α = 0o N =33 000 Výhody: Nevýhody: • Krátká dráha Zvíření • Úzká zóna

  10. Výměnné rotory Beckman

  11. d. se zonálním rotorem • Jádro rotoru s přívody • Jádro s rameny • Stěna rotoru • Vrotoru = 0,6 – 1,6 l • Vvzorku = 20 – 200 ml • 4. Gradient hustoty • 5.Podložní roztok – cushion • 6.Překrývající roztok – overlay • Postup • Plnění N = 103 ot/min • Dělení centrifugací • N = 104 ot/min • 3. Vytlačování • N = 103 ot/min

  12. Čištění transformační DNA z b.subtilis centrifugací v zonálním rotoru 27 mg surové DNA/15 ml Gradient sacharosy 5-30% Citrátový pufr pH 7,0 Cushion – 50 ml 42% sach. Overlay – 100 ml pufru Plnění - 2 000 ot/min Dělení – 40 000 ot/min 7 hod Jímané frakce 10 ml Bílkoviny + RNA DNA agregáty DNA 2,5 S 26 -35 S

  13. 4.2.2. KONTINUÁLNÍ ODSTŘEDIVKY Typ SHARPLES N = 40 000 ot./min Výhoda: Velká kapacita 20 – 50 l/hod. Suspenze i emulze Průmyslové kaly

  14. 4.3. POUŽITÍ CENTRIFUGACE Centrifugace – nejčastější metoda, nejdůležitější • Separace (čištění) průmyslové kaly, emulze,  bílkoviny, NK, organely, buňky, viry, Diferenciální – počátek separace, zpracování homogenátů tkání, náhrada FILTRACE Zonální – dokonalejší, frakcionace • Analýza - M

  15. )

  16. 4.4. ANALYTICKÁ ULTRACENTRIFUGACE • 20.léta Svedberg a j.: důkaz – makromolekuly ne agregáty, ale spojeny kovalentními vazbami  rozvoj chemie makromolekul • 1958 Mathew MESSELSON + Franklin STAHL: důkaz semikonzervativní replikace DNA  rozvoj molekulární biologie • Expanze a útlum AU • Vzkříšení v 90. letech: kombinace moderních přístrojů a počítačového softwaru pro zpracování dat • AU SV – sedimentační rychlost: S a hydrodynamické vlastnosti • SE – sedimentační rovnováha: M, Kasociace

  17. Důkaz semikonzervativní replikace DNA 1958 Mathew MESSELSON + Franklin STAHL

  18. 4.4.2. ANALYTICKÁ ULTRACENTRIFUGA

  19. Analytická centrifuga BECKMAN –COULTER XL-I • 100 000 rpm • T = 4 - 40ºC • Detekce→ UV, VL absorpce, interference index lomu  • Detekce neabsorbujících biomakromolekul (sacharidy) • Detekce změn konformace nebo asociace bílkovin vlivem ligandů nebo léčiv • Vhodnější pro SV celých buněk – rychlejší akumulace dat

  20. 4.4.3. ANALYTICKÁ CENTRIFUGA- DETEKCE Šlíry (index lomu) Interference Fotografická absorbance (Schachman 1959) Fotoelektrická absorbance- současný optický systém

  21. Kyveta pro AU • Dráha – 1,5 cm • Obsah 20-200 μl • c - 0,1mg/ml

  22. 4.4.4. ANALYTICKÁ ULTRACENTRIFUGACE -VYUŽITÍ • Stanovení M • Bez kalibrace (x GPC a ElFo) • Široký rozsah: 102 (sacharosa, AA) – 106 (viry, organely) !!! • Malé množství (20 – 120 μl) i c (0, 01 – 1 g/l), i vysoká c • Stanovení homogenity • rychlé, kvantitativní určení distribuce částic, stupeň agregace • volně v roztoku, nativní, bez případné interakce s matricí • Analýza asociujících systémů – široký rozsah: • interakcí jak existují v roztoku (makromolekuly s ionty a malými, solvatace, agregace) • M • c • K (10 – 100 M-1 ) 4. Určení pravděpodobného tvaru (koule x cylinder). Detekce konformačních změn ?

  23. 4.4.5. ANALYTICKÁ ULTRACENTRIFUGACE - ZÁVĚR AU je všestranná, přesná metoda pro studium biomakromolekul v roztoku při vybrané T • M a S • Kasociace • Solvatace, agregace • Heterogenita roztoku • Tvar, změny konformace

More Related