1 / 54

Az RNS vil ág , hibak üszöb

Az RNS vil ág , hibak üszöb. Kun Ádám Növényrendszertani és Ökológiai Tanszék és Collegium Budapest. Az Élet kialakulása előtt. Az első élőlények rendelkeztek Sejtmembránnal Anyagcserével Örökítőanyaggal Hogy jutottunk el idáig?

tyler
Download Presentation

Az RNS vil ág , hibak üszöb

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Az RNS világ, hibaküszöb Kun Ádám Növényrendszertani és Ökológiai Tanszék és Collegium Budapest

  2. Az Élet kialakulása előtt... • Az első élőlények rendelkeztek • Sejtmembránnal • Anyagcserével • Örökítőanyaggal • Hogy jutottunk el idáig? • Mi volt az ősleves (pizza) és az első élőlények közötti időben?

  3. Mi volt előbb a tyúk vagy a tojás? • Fehérje enzimek • DNS örökítőanyag • Lipid membrán

  4. RNS világ Az RNS lehet enzim és információhordozó DNS és fehérje világ előtt RNS világ A DNS stabilabb a fehérje pedig változatosabb és hatékonyabb enzim

  5. RNS világ • RNS világ bizonyítékai • RNS világ lehetőségei • RNS világ kialakulásának megoldatlan problémái • RNS világ fejlődésének problémái

  6. RNS világ bizonyítékai a mai szervezetek biokémiájában I Természetes RNS enzimek (ribozim) Mindegyik RNS hasítást katalizál • I. Csoportbeli intronok • II. Csoportbeli intronok • RNáz P • Kalapácsfej • Hajtűhurok • Hepatitis Delta Vírus • Neurospora Varkund Satelite RNA Joyce, G. (2002) Nature 418:214-221 alapján

  7. ATP RNS világ bizonyítékai a mai szervezetek biokémiájában II: Koenzimek NADP FAD • Koenzimek: valamilyen specifikus kémiai csoport átadásában résztvevő metabolitok (rengeteg reakcióban) • Acetyl koenzim A (koenzim A): acetyl csoport • NADH, FADH2 (NAD+, FAD): hidrogén és elektron • ATP (ADP): nagyenergiájú foszfát CoA NAD

  8. tRNS • Aminosavat szállít a transzlációhoz • Lehet koenzim is! Glutamil-tRNA + 2 H+ + 2 NADPH L-Glutamát-1-félaldehid + NADP+ + tRNAGlu

  9. RNS világ bizonyítékai a mai szervezetek biokémiájában III • Dezoxi-ribonukleotidok ribonukleotidokból keletkeznek (de ezt valószínűleg ribozimek nem tudják katalizálni). • Riboswitches: Génreguláció vélhetően legősibb formája. Az mRNS térszerkezete határozza meg, hogy lefordítódik fehérjévé.

  10. RNS világ bizonyítékai a mai szervezetek biokémiájában IV: Transzláció • mRNS • tRNS • riboszóma A DNS  fehérje „átmentet” (transzláció) RNS közvetítésével történik Riboszómában a peptidil transzfert egy ribozim végzi!

  11. RNS világ lehetőségei Mesterséges evolúcióval előállított enzimek SZINTÉZIS v. VÉLETLENSZERŰ MOLEKULÁK • SZELEKCIÓ • Affinity chromatography • Filter binding • Gel mobility shift • Imunopercipitation EVOLVÁLÓDOTT MOLEKULA SOKSZOROZÓDÁS mutagenic PCR

  12. RNS világ lehetőségei:RNS szintézis • Nukleotid képzés pirimidinből és aktivált ribózból • Polinukleotidok 5’ foszforilációja • 5’ foszfát aktiválása 5’,5’ pirofoszfát kötött nukleotid kapcsolással • Ligáz aktivitás • Legjobb szintetáz kb. 200 bázis hosszú és 14 nuklotidot tud egy templát alapján hozzákapcsolni egy oligonukleotid lánchoz 97.5%-os másolási hűséggel.

  13. RNS világ lehetőségei: Protein szintézis Protein szintézis minden lépése megoldható • Aminosavak aktiválása (sokféle aminoaciláció) • Peptid kötés kialakítás

  14. RNS világ lehetőségei:Egyéb reakciók • amid kötés bontás • alkiláció • porfirin metiláció • kén alkiláció • Diels-Alder cikloaddíció • Amid kötés kialakítás • hidas bifenil izomeráció

  15. Egy ribozim a részeiből is összeállhat működő ribozimmé E. coli RNáz P M1 részét darabolva, azok összeállnak működő ribozimet alkotva. Kisebb részleteket jobban lehet replikálni Egy szekvencia, két ribozim HDV-t és class III ligáz-t egyesítő ribozimet állítottak elő, úgy, hogy olyan szekvenciát kerestek, amely mindkét szerkezetet felveheti. Működő enzimeken keresztül vezethet az út egyik funkcióból a másikba RNS világ lehetőségei:Érdekességek

  16. RNS világ kialakulásánakmegoldatlan problémái • Rengeteg féle cukor, bázis • Sztereokémia • Pirimidinek prebiotikus keletkezése kérdéses • Nukleotidok képződésének sebessége nagyon kicsi • Polimerizáció során 2’-5’; 3’-5’ és 5’-5’ kapcsolatok

  17. Az RNS világ fejlődése • Tekintsünk el az előbbi problémáktól! • Legyen aktivált monomerünk. • Legyenek oligonukleotidjaink Hogyan alakulhat ki ebből egy RNS világ?

  18. Az RNS világ fejlődése: Az Eigen paradoxon • A replikáció nem hibátlan (főleg nem replikáz és javító mechanizmusok nélkül) • Mekkora információ (milyen hosszú RNS szál) tartható meg adott másolási pontosság mellett?

  19. „Replikáció” egy példája RNA RNA RNA RNA RNA RGA RNA RNA RNA RNX RNA RNA RNH DNM RNA RNA RNA RQA RNA RNJ RPA WORLD WORLF WORLD WORLL IDRYD WORLD WORLD KORLD WORLD WORLD WORLD WORLD WORUD WORLD WORHD WORLD WORLD WORWD WORLD WORLD WRRLD HYPOTHESIS EYPKTHYSII HYPEXHESIS HYPOTHESIS HYPOTHESIS HYPETHESKS HYYOTHESIS HYPOTHESIS HYPOTHESIS HYPOTHESIS HYPOTHESIS HYPOTHESIS HYPOSHESIS HYPOTMESIS HTPOTHESIS CYPOTGESIS HYPOTHEGIA HYPOXHLSIS HYPXTHESIS HYPOTHESIS HYPUTHESIS

  20. Az Eigen paradoxon: Modell • xi molekula conc. • Ai másolási sebesség • wij mutáció j-ből i-be • D és F az állandó kocentrációért • Q a másolási hűség, Q=qN • q a bázisonkénti másolási hűség

  21. Eigen paradoxon: A paradoxon • Együtt tud-e élni egy mesterkópia, a mutánsaival? • ahol s az eredeti szekvencia szelekciós fölénye • Hosszabb RNS-hez jobb (hosszabb enzim kell), de a hosszabb enzimet nem tudja megtartani a rendszer Tehát mondjuk 97.5% pontossággal másoló 200 nukleotidból álló replikáz nem tudja fenntartani saját magát.

  22. Hibaküszöb N=50 Swetina és Schuster 1998 alapján

  23. Genotípus - Fenotípus • Genotípus a szekvencia (bázissorrend) • A fenotípus az Eigen modellben szintén a bázissorrend Mesterkópia: AUCGUCUGUCGGCGAU A két szekvencia teljesen különbözik. A mutáns fitnesse 0 Mutáns: GCAUGACUCAUUAUGC

  24. RNS struktúra Neurospora VS ribozim 144 nukleotid hosszú

  25. RNS másodlagos szerkezet • Bázispárok számától függ a szabadenergia. • Dinamikus optimalizáció a bázispárok számának maximalizálására (energia minimalizálására) • A bázispárok energetikáját kísérletesen vizsgálják

  26. RNS másodlagos szerkezet meghatározás Szekvencia R=r1, r2, r3, ..., rn; ahol ri{A,C,G,U} Másodlagos szerkezet S = i.j bázispárok rendezett halmaza • 1i< j  N • j - i>3 • i.j és k.l bázispárokra (i<k) igaz az egyik: • i=k és j=l (ugyanaz a bázispár) • i<j<k<l (egymás után jönnek) • i<k<l<j (i.j magába foglalja k.l-t) Keressük a legalacsonyabb energiájú (vagy ahhoz közeli) szerkezetet, feltehetően ez a másodlagos szerkezete egy RNS molekulának

  27. Másodlagos szerkezet energiája A srtruktúra energiája a hurkok energiájától függ Bármely struktúra egyértelműen felbontható m+1 (m a bázispárok száma) hurokra halmozódó bázispár elágazás hajtűkanyar kitüremkedés belső hurok A struktúra energiája, így az egyes hurkok energiájának összege

  28. Struktúra a fenotípus • A másolási sebesség, vagy az enzimatikus aktivitás a struktúrától függ. • Egy RNS molekula fenotípusa nem a bázissorrend, hanem a struktúra. • 4N szekvencia lehetséges, mennyi struktúra? • Hogyan határozzuk meg a struktúrát

  29. RNS tájképek • Kémiailag és fizikailag megalapozott genotípus-fenotípus térkép • Ilyen máshol még nincs a biológiában

  30. RNS tájképek tulajdonságai I • Körülbelül 2.35N struktúra, azaz egy struktúrához több szekvencia tartozik. • Kevés mutáció (1-3) általában nem változtatja meg a struktúrát • Ha van egy kompatibilis szekvenciánk, akkor az átlagosan 7.2 mutációval olyanná alakítható, hogy kívánt MFE struktúrája legyen

  31. RNS tájképek tulajdonságai II Mesterkópia: Azonos struktúra Azonos fitness AUCGUCUGUCGGCGAU Mutáns: GCAUGACUCAUUAUGC • Semleges utak a tájképen • Az utak 21.7%-a perkolál

  32. RNS tájképek tulajdonságai III • Vannak gyakoribb struktúrák • A szekvenciák zöme gyakori struktúrát vesz fel (evolválódott ribozimek minden bizonnyal gyakoriak) • A struktúrák zömét csekély számú szekvencia veszi fel • Minden szekvencia körüli kb. 20 mutációval elérhető gömbön belül minden gyakori struktúra elérhető

  33. RNS tájképek következményei • Az evolválódott ribozimek minden bizonnyal gyakori struktúrák. • A hibaküszöböt egy megengedőbb fenotípikus hibaküszöb váltja fel. • Az Eigen paradoxont ez nem oldja meg, de megoldását könnyebbé teszi.

  34. Ribozimok rátermettség tájképe • A fenotipikus hibaküszöb becsléséhez szükségünk van egy rátermettség tájképre • A rátermettség tájkép kísérletes adatokra épül • Feltételezzük, hogy az enzimaktivitás arányos a rátermettséggel (protosejt)

  35. A vizsgálat célja • Valós ribozimokra rátermettség tájkép szerkesztése • Ilyen tájkép előállításának általános menete • Fenotipikus hibaküszöb becslése

  36. Mely ribozimok jöhetnek szóba? 1. Jól karakterizált Csak a természetes ribozimok teljesítik ezt a kritériumot 2. Nem túl hosszú(praktikus ok) Az I-es és II-es csoportbeli intronok kiesnek 3. Nem lehet a transz ható enzim szerkezetbenpszeudo-csomó(algoritmus követelménye) Hepatitis Delta Virus kiesik e miatt Neurospora VS Ribozyme, Hairpin, Hammerhead

  37. Neurospora Varkund Satellit Ribozim N = 144 A pozíciók 83/144 (57%) mutálva van, mi összesen183 mutánst vettünk figyelembe

  38. VS Ribozim: mutációs kísérletek 144 nukleotidból 87-en végeztek mutációs kísérletet Összesen 183 mutánst vizsgáltak

  39. VS Ribozim Elágazások fontosak Aktív hely Hossz nem fontos Hossz nem fontos Kitüremkedés nem lehet a másik száron, de törölhető Szubsztrát kötés

  40. Hairpin Ribozyme N = 50 A pozíciók 39/50 (78%) mutálva van, összesen 142 mutáns vettünk figyelembe

  41. Ribozimokkal kapcsolatos általános megfigyelések • A szerkezet a fontos, nem az egyedi bázispárok • A szerkezet kissé változtatható • Vannak kritikus helyek • A tájkép multiplikatív(lehet hogy van egy gyenge szinergia)

  42. Általános funkcionalitás tájkép Rendeljen minden lehetséges 4Nszekvenciához egy relatív enzimaktivitást • Kompatibilis szerkezet • Hibás bázispár • Kritikus helyek • Jósolt struktúra

  43. I. Kompatibilis szerkezet • A célstruktúrának megfelelő bázis-párok mindegyike – legtöbbje – ki tud-e alakulni? • Néhány hibás pár (rosszul párosított bázispár) megengedhető, de • Nem lehet kettő ilyen egymás mellett • Nem lehet egy régióban kettőnél több • Aa szekvenciával kompatibilis struktúrának megfelelő aktivitás.

  44. II. Hibás bázispárok • Minden megengedett hibás bázis-pár csökkenti az aktivitást • Az elhelyezkedésüktől függően más hatásuk lehet az egyes hibás pároknak

  45. III. Kritikus helyek • Minden lehetséges nukleotidhoz rendelünk aktivitást ezeken a helyeken.

  46. IV. Jósolt szerkezet • A 2D szerkezet meghatározása.(Vienna RNA Package) • Elfogadjuk, ha a célszerkezetbe tekeredik. • A MFE nem biztos, hogy a kísérletesen meghatározott másodlagos szerkezet

  47. RNS populáció dinamikája • 1000 RNS molekula • Szaporodás esélye arányos a fitnesszel • A másolás pontatlan, de a molekula hossza állandó • Degradáció sebessége azonos minden szekvenciára

  48. A tájkép tulajdonságai l = 0.22 l = 0.26

  49. Fenotipikus hibaküszöb VS Ribozim Hajtű m* = 0.146 m* = 0.053

  50. Más tájképekkel összehasonlítva • Mnt. Fuji típusú tájkép • Nincs szerkezet • Az aktivitások pontmutációk alapján • Egycsúcsú rátermettség tájkép • Az egyszeres mutánsok átlagos aktivitása alapján

More Related