Лекция 2 Генетическая система пластид

1. Лекция 2 Генетическая система пластид Методы обнаружения ДНК в пластидах (краткая история) Параметры пластидной ДНК. Нуклеоиды – пластидные ядра Первичная структура ДНК пластид Генетическая компетентность пластид

2. Как формируются ткани растений, содержащие хлоропласты? Клетка меристемы( 15μm ) Клетка мезофилла (65 μm) Превращение меристематической клетки ячменя с 10 пропластидами диаметром 1 μm в мезофильную клетку листа с 65 хлоропластами диаметром 6-8 μm

3. пропластида лейкопласт хромопласт хлоропласт Формирование и взаимопревращение пластид

4. Пропластида Этиопласт Алейропласт Амилопласт Элайопласт Лейкопласт Хлоропласт Хромопласт запасание фотосинтез окрашивание

5. Предыстория… В конце 18 века итальянец Компаретти: «пластиды – гранулы растительной клетки». 1846 год Нэгели наблюдал деление пластид у водоросли нителла 1858 г. Трекул первый зарисовал пластиды Термин пластиды появился в конце 19 века

6. История обнаружения ДНК в пластидах Исследование изолированных пластид 1938 –осаждение хлоропластов из листьев шпината, выделено вещество нуклеопротеиновой природы. Начало 50-х годов: в этой фракции были найдены азотистые основания ДНК и РНК в хлоропластах – 0.1-0.2% от сухого веса пластид

7. Красители: пиронин, метиловый зеленый, азур, краситель Фельгена Гистохимия 1951-1956 РНК была обнаружена при окраске пиронином в хромопластах моркови и при окраске азуром в этиопластах кукурузы Окраска на ДНК по Фельгену не всегда давала положительный результат Таким образом,гистохимически ДНК не всегда обнаруживалась, что привело к поиску других, более чувствительных методов

8. 1957 г Электронная микроскопия Рут Сэджер у хламидомонады увидела рибосомоподобные частицы диаметром 100-150 А, позднее они были найдены в хлоропластах высших растений и у других водорослей При предварительной обработке РНКазой частицы не выявлялись

9. 1958 г.Авторадиография – показано включение в пластиды Н3-тимидина (водоросли Acetabularia), через несколько лет включение Н3- тимидина - в пластиды табака Тритий включается только в пластиды из молодых листьев 1961г. - Совместное применение ЭМ и АВТР (меченые основания) помогло показать синтез ДНК в пропластидах папоротника, а также синтез ДНК+РНК в этиопластах кукурузы

10. 1961 г. Рис и Плаут обнаружили в хлоропластах хламидомонады фибриллы диаметром 25-30А, исчезавшие при обработке ДНКазой и удивительно напоминавшие бактериальную хромосому. Подобные нити былинайдены позднее и у других растений (1962) Электронная микроскопия привела к обнаружению в пластидах ДНК в виде фибрилл и РНК в виде рибосомоподобных гранул

11. ДНК Аутофлуоресценция хлорофилла Нуклеоиды хлоропластов – пластидные «ядра» DAPI-окраска Cyanidioschyzon merolae – красная водоросль Фазово-контрастные изображения Целые клетки Blue indicates DNA and red indicates the chlorophyll autofluorescence on the thylakoid. cpn, chloroplast nucleoids; mtn, mitochondrial nucleoids; n, nuclei. Bar in (F) = 3 µm for (A) to (F). Изолированные пластиды Субфракция хп-нуклеоидов

12. По крайней мере у некоторых низших водорослей ДНК образует нуклеоиды с помощью гистоноподобных белков Флуоресцентная иммунолокализация белка HCв нуклеоидах пластид DAPI-окраска Одна и та же клетка у

13. Особенности организации растительных нуклеоидов (часть 1) 1. Нуклеоиды – это несколько копий пластидной ДНК, плотно упакованных в большие нуклеопротеиновые частицы 2. Нуклеоиды можно видеть во флуоресцентном микроскопе после окрашивания тканей ДНК-интеркалирующими флуоресцентными красителями, например DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) 3.Число, форма и размеры нуклеоидов варьируют в зависимости от вида: - число нуклеоидов в клетке обычно 5-10 (может быть от 1 до 100) - у водорослей и высших растений описано 5 вариантов формы нуклеодиов – от сферической до кольцеобразной; 4. Количество пластомных копий на нуклеоид зависит от вида растений и от стадии дифференцировки пластид: - пропластиды часто содержат только один нуклеоид; - зрелые пластиды могут содержать более 10-12 нуклеоидов; 5. Нуклеоид и, вероятнее всего, каждая отдельная ДНК-копия, связаны с мембранами пластид: с тилакоидной мембраной и с внутренней мембраной пластиды;

14. Кольцевые нуклеоиды пластид одноклеточной водоросли Heterosigmaakashiwo токсическая водоросль, распространена повсеместно в прибрежной зоне

15. Особенности организации растительных нуклеоидов (часть 2) 6. Изолированные нуклеоиды сохраняют транскрипционную активность in vitro:это свидетельствует о том, что транскрипционный аппарат тесно связан с ДНК пластид; 7. Совершенно неясно, как контролируется число геномных копий, которые «упаковываются» в один нуклеоид; 8. Обнаружено несколько ДНК-связывающих нуклеоидных белков, самый изученный Н1р - гистоноподобный 9. Число нуклеоидов на клетку определяется ядерными генами; признак может мутировать В норме у Chlamydomonas ~ 7 нуклеоидов Получены мутанты c резко увеличенным или уменьшенным числом нуклеоидов: 14-23 нуклеоидов 1 нуклеоид мутант MOC

16. (A)Линейная молекула хпДНК. (B)Два мономерахпДНК – линейный и кольцевой (C)Димер хпДНК (180 µm). (D)Линейные молекулыхпДНК Хлоропластная ДНК хламидомонады

17. Каковы молекулы? Хлоропластные ДНК чаще всего - кольцевые (эвглена, 1971). Длина кольца – от 36 до 62 микрон Длина кольца постоянна для каждого вида растений, обычно 44-46 мкм. Обнаруживаются также линейные молекулы, димеры, сцепленные димеры У табака и арабидопсиса обнаружены мультимеры: 6-10 геномных копий Сколько их в клетке ? Копий пластидной ДНК на органеллу 20-1000 Пластид в клетке несколько сот Число пластидных геномов на клетку – от 2000 до 50000 В хромопластах геномных копий намного меньше В онтогенезе число пластидных ДНК копий может меняться в 10-30 раз .

18. Растение % от тотальной ДНК Геномов на клетку Геномов на пластиду Горох 12 10000 270 Соя 17 13000 - Шпинат 23 13000 200 Свекла 11 1900 100 Картофель 8 3000 22 Пшеница 17 50000 900 Максимальные уровни хлоропластной ДНК в листьях на свету

19. LSC 65696 Черная сосна 119707 п.н. IR 495 IR 495 SSC 53021 Сравнение пластомов некоторых высших растений, для которых установлена полная нуклеотидная последовательность LSC IR Растение-паразит (не фотосинтезирует) 19799 22735 Epifagus virginiana 70028 п.н. SSC 4759 IR 22735

20. Вариации размеров однокопийных районов и инвертированных повторов хлоропластных ДНК покрытосеменных: Pelargonium hortorum, Spinacia oleracea, Coriandrum sativum кориандр

21. 1976 г. – первая физическая карта хлоропластного генома кукурузы Физическая карта дает представление о размере генома и потенциальной кодирующей способности, но не о конкретных генах

22. Хлоропластная ДНК Генетическая карта пластидной ДНК табака -1986 год

23. Пластидная ДНК сосны

24. Пластидная ДНК Chlamydomonas Кольцо показывает гены и ORFs неизвестной функции. Наружное кольцо– гены с известной или предполагаемой функцией

25. Пластидный геном водоросли Nephroselmisolivacea содержит больше всегогенов – 127 7 геновхп ДНКNephroselmis есть только у этой водоросли: это РНКкомпонентРНКазы P (rnpB), генtrnS(cga), 5 белок-кодирующих генов из них гены ycf81 и ftsI раньше обнаруживались только у бактерий

26. Наземные растения Водоросли Фотоcин тетикиb Epifagus Chlorella Euglena Odontella Porphyra Cyanelle Всего 105~113 40 105 87 129 183 145 Генетическая система 59~63 38 61 58 78 98 79 Фотосинтез Rbc- тилакоиды NADH-дегидрогеназы Фикобилисомы 31~32 11 0 03227424441 0 0 0 0 0 0 0 00 010 7 Биосинтез и прочие гены 2~8 2 11 2 9 31 18 Перечень известных генов некоторых секвенированных геномов

27. L23 L2 S19 L22 S3 L16 L14 S8 IF1 L36 S11 α Гены белков рибосом пластид ! Гены рибосомальных белков пластид собраны в опероны 12 генов пластид собраны в самый большой хлоропластный кластер ctL23 Только немногие пластидные гены транскрибируются моноцистронно (например, psba, rbcL), все остальные по полицистронному типу (как у прокариот)

28. За 20 лет (1986-2006) полностью секвенировано 58пластидных геномов: 40 – семенных растений 5 – зеленых водорослей 4 - красных водорослей 9 – других организмов (водоросли, токсоплазмы и пр.)

29. Генетическая компетентность пластид разных систематических групп тРНК гены: 25-35 (17) рРНК гены: 3-5 Белок-кодирующие гены: 21-133

30. РНК-полимераза пластид кодируется четырьмя генами rpo РНК-полимераза E. сoli хлоропласт N и С- части β'-субъединицыкодируются разнымигенами 4 субъединицы а2ββ' 5 субъединиц а2ββ'β'' rpoA rpoBrpoC1 rpoC2 rpoA rpoBrpoC Гены rpo E.coli гибридизуются с ДНК пластид, что помогло обнаружить и локализовать rpoгены в хпДНК

31. РДФК (RBC) - основной белок стромы хлоропластов состоит из одинаковых 8 больших и 8 малых субъединиц. Белок кодируется двумя геномами: Ядерный rbcS Хлоропластный rbcL У бурых и красных водорослей оба гена кодируются пластидной ДНК SS – малая субъединица 12-15 kD LS – большая субъединица 50-55 kD Гены мембран тилакоидов: гены ФС1; (5 генов psa) гены ФС2; (12 генов psb). ген psbА один из наиболее изученных, так как связывается с атразином и др. гербицидами. цитохромный комплекс b/f (5 из 7 кодируются хп геномом) ATФ-синтаза (два комплекса, 5 и 4 субъединицы; хп геном кодирует по 3 субъединицы каждого комплекса). Гены NADH- дегидрогеназы Выявлены участки, кодирующие посл-ти, гомологичные белкам дыхат. цепи митохондрий. Эти гены активно транскрибируются, но роль их в хп пока неясна. У хп водорослей эти гены не найдены!

32. Итак, за 50 лет: • построены полные карты нуклеотидных последовательностей хлоропластной ДНК для 88 разных в систематическом отношении групп растений ( год назад – 58!) • идентифицировано на этих картах множество генов, относящихся к разным функциональным группам; • выяснены особенности группировки этих генов в кластеры.