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Molecular biology for ecologists

Molecular biology for ecologists. DNA. DNA ：细胞核、线粒体、叶绿体. nrDNA mtDNA cpDNA. 核酸. RNA ：细胞质. nrDNA. 核酸. 核苷酸. 磷酸. 核苷. 戊糖. 碱基. C. T. nrDNA. nrDNA. T. C. A. G. Q ：对于 GC 含量高的 DNA 模板，在 PCR 过程中，需要注意什么？. nrDNA. DNA 的一级结构. 4 种核苷酸的连接及其排列顺序 表示了 DNA 分子的化学构成. nrDNA. DNA 的二级结构.

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Presentation Transcript

  1. Molecular biology for ecologists

  2. DNA DNA：细胞核、线粒体、叶绿体 nrDNA mtDNA cpDNA 核酸 RNA：细胞质

  3. nrDNA 核酸 核苷酸 磷酸 核苷 戊糖 碱基

  4. C T nrDNA

  5. nrDNA T C A G Q：对于GC含量高的DNA模板，在PCR过程中，需要注意什么？

  6. nrDNA DNA的一级结构 4种核苷酸的连接及其排列顺序 表示了DNA分子的化学构成

  7. nrDNA DNA的二级结构 2条多核苷酸链反向平行盘绕所生成的双螺旋结构

  8. nrDNA DNA的二级结构

  9. nrDNA DNA的三级结构 DNA分子通过扭曲和折叠形成的特定构象

  10. nrDNA DNA的四级结构 DNA与蛋白质复合物的结构

  11. nrDNA Q：电泳检测PCR产物分子量大小时，为什么要先进行PCR产物的变性？

  12. DNA的性质 • 水解性：糖苷键，磷酸二酯键 • 酸碱性：磷酸基，碱基 • 紫外吸收：碱基 • 变性与复性：双螺旋结构

  13. 水解 • 酸解性 • 对酸最不稳定的是嘌呤和脱氧核糖之间的糖苷键 • 碱水解 • DNA无2’-OH，不能形成碱水解的中间产物，对碱有一定抗性 • 酶水解

  14. 水解 • 酶解性 • 磷酸二酯酶：非特异性水解 • 核酸酶：专一水解 • 核酸内切酶 • 核酸外切酶

  15. 限制性内切酶 1. 具有较高的专一性。能识别DNA分子中上特有的碱基顺序，并在特有的位点上切割。其识别顺序大多具有回文结构，回文结构也称反向重复序列。

  16. 限制性内切酶 1. 具有较高的专一性。能识别DNA分子中上特有的碱基顺序，并在特有的位点上切割。其识别顺序大多具有回文结构，回文结构也称反向重复序列。 2. 大多数限制性内切酶对两条DNA链进行交错切割，所以切割后形成末端为单链的互补顺序，即粘性末端。

  17. 限制性内切酶

  18. 限制性内切酶的命名 EcoRI 材料属名的第一个字母 该材料中已分离出的该类酶的编号 材料种名的头两个字母 所用菌株

  19. 限制性外切酶

  20. DNA的性质 • 水解性：糖苷键，磷酸二酯键 • 酸碱性：磷酸基，碱基 • 紫外吸收：碱基 • 变性与复性：双螺旋结构

  21. DNA的酸碱性 当pH > pI时， =N+H－上的H+解离下来 核苷酸带负电 凝胶电泳分离核酸

  22. DNA的凝胶电泳 • 迁移率 • 分子大小 与分子量对数成反比 • 胶浓度 与胶浓度成反比 • DNA构象 超螺旋 > 线性 > 开环 • 电流 与电流大小成正比5V/cm • 碱基组成 影响不大

  23. 紫外吸收性质 核酸的最大吸收值在260nm附近

  24. 蛋白质的最大吸收值在280nm附近

  25. DNA纯度的检测 = 2.0 纯RNA 1.8 - 2.0 DNA纯度高 A260/A280 < 1.8 有蛋白

  26. DNA浓度的检测 A260 = 1 等价于 50 μg/mL 双螺旋DNA 40 μg/mL 单链DNA或RNA

  27. DNA的性质 • 水解性：糖苷键，磷酸二酯键 • 酸碱性：磷酸基，碱基 • 紫外吸收：碱基 • 变性与复性：双螺旋结构

  28. DNA的变性与复性 DNA变性： 指双螺旋区的氢键断裂，形成单链无规则线团的过程。

  29. DNA的热变性 DNA热变性 爆发式 发生在很窄的温度范围内

  30. DNA的热变性 DNA的熔点 Tm 加热变性使DNA双螺旋结构失去一半时的温度 82 - 95℃

  31. Tm与GC含量

  32. Tm与介质离子强度 ∝ Tm 介质离子强度 DNA制品不应保存在极稀的电解质溶液之中，在含盐缓冲液中保存较为稳定

  33. DNA的复性

  34. DNA的复性 • 变性DNA • 缓慢冷却，DNA复性 • 退火 • 2. 骤然冷却，不能复性 • DNA电泳前的变性 核酸杂交：Southern杂交

  35. DNA的复制

  36. 转录 翻译 复制 DNA mRNA 蛋白质 反转录 翻译 蛋白质 （病毒） 复制 RNA （病毒） 中心法则

  37. DNA的复制： 以亲代DNA为模板，根据碱基配对的原则，在一系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代DNA的过程。

  38. DNA的半保留复制 模板：亲代DNA双链 碱基互补 新形成的子代DNA中，一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的 DNA的复制需要模板的指导！

  39. DNA的半不连续复制 以5’ →3’方向的亲代链为模板的子代链先逆复制叉移动方向合成冈崎片段，再连接成滞后链。

  40. DNA的半不连续复制 DNA复制需要引物启动

  41. DNA链的延伸 DNA聚合酶Ш催化 底物:四种5’-脱氧核苷三磷酸 在RNA引物的3’端以磷酸二酯键连接上脱氧核糖核苷酸并释放出焦磷酸。

  42. DNA链的延伸 DNA链的延伸 冈崎片段怎么连接？ DNA连接酶 RNA引物怎么办？ 5’ 3’核酸外切酶 碱基错配怎么办？ 3’ 5’核酸外切酶

  43. DNA复制体系 模板：母链DNA 引物：一小段RNA 原料：dNTP 酶和蛋白质因子：DNA聚合酶 DNA连接酶 DNA外切酶

  44. DNA复制对分子生态学研究的意义 • 引物 可以根据研究需要设计相应的引物 扩增特定的片段 • 游离的3’-OH 当3’-OH脱氧时，DNA链不能延伸 双脱氧测序法

  45. PCR Polymerase chain reaction Mullis 1993 诺贝尔化学奖

  46. 模板

  47. 模板

  48. dNTP，引物，Taq聚合酶

  49. dNTP ATP

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