Hematoxylin 의 산화제와 매염제

1. Hematoxylin • Hematoxylin의 산화제와 매염제 • Hematoxylin 염료 자체는 조직과 친화성이 거의 없어 HgO (mercuric oxide), NaIO3(sodium iodate)과 같은 산화제를 첨가한 후 산화과정을 거쳐 자색의 hematein으로 전환시키는 숙성(ripening)과정을 거친다. • 그러나 이 hematein도 조직성분과 강하게 결합할 수 있는 화학적 기능기가 없기 때문에 염료로서의 결합능을 획득하기 위해서는 매염제의 도움을 받아야 핵과 결합할 수 있다.

2. Hematoxylin • Hematoxylin의 산화제와 매염제 • 매염제가 첨가되면 hematein내의 OH 기와 금속이온 사이에 정전기적 결합이 일어나고, 다음 hematein 산소 원자가 금속이온과 배위결합(coordinate bond)하여 오각형의 고리(AI-O=C-C-O)가 형성되면서 안정한 구조인 hematein-mordant complex인 hematein lake가 형성 • 이 lake는 양(+)으로 하전되며, 조직성분 중 음 (-)의 성질을 띤 부위 (세포핵 등)와 이온결합하여 청자색 내지 청색으로 염색

4. Hematoxylin • Hematoxylin의 산화제 • 자연산화 • 빛이나 공기중에 노출시켜 자연적으로 산화시켜 숙성시키는 방법으로 숙성기간이 3~4개월이 걸리지만 일단 숙성되면 염색능의 보유시간이 길다 • Ehelich와 Delafield hematoxylin

5. Hematoxylin • Hematoxylin의 산화제 • 화학적 산화 • 화학적 산화제를 사용하여 인위적으로 숙성시켜 사용하는 방법으로 산화가 신속히 진행되므로 염색능의 보유기간이 짧다. • Sodium iodate, potassium permanganate, mercuric oxide, hydrogen peroxide, sodium perborate 등의 산화제와 혼합하면 매우 신속히 산화 • hematein으로 1차 산화된 후에도 계속적인 산화반응을 하여 용액위에 금속성 침전물 막을 형성하므로 hematoxylin 용액은 사용전에 필히 여과

6. Hematoxylin • Hematoxylin의 산화 Hematoxylin 용액의 사용 여부 판별법 Before filtration After filtration Hematoxylin solution

7. Hematoxylin • Hematoxylin의 매염제 • Hematein이 조직 구조에 대한 친화력이 약하기 때문에 매염제가 같이 사용 • 매염에 쓰이는 금속염은 ferric ammonium alum, ferric chloride, common alum(NH4, K salt), iron, phosphomolybdic acid, phosphtungstic acid, chromium, copper, aluminium 등의 물질(염)과 혼합하여 사용 • 조직검사실에서는 매염제로 aluminium과 iron을 주로 이용 • Iron과 ferric salt는 산화제와 매염제의 기능을 갖고 있어 산화제를 첨가하지 않는다.

8. Type of hematoxylin • Aluminium mordanted hematoxylin • Aluminium으로 매염된 hematoxylin 용액은 병리검사실에서 핵염색액으로 널리 이용되며, 조직표본에서 정상핵과 비정상핵을 잘 구별 • Dye-mordant lake는 조직과 결합할 때 초기 정전기적 결합에서 공유결합으로 전환되어 결합력이 강해 alcohol 처리에도 저항성이 있다. • 대부분의 alum hematoxylin 용액의 pH는 2.2~2.9 범위인데, 이는 핵산의 등전점이 pH 1.5~2.0 이므로 그 이상에 위치

9. Type of hematoxylin • Aluminium mordanted hematoxylin • 종류 • Harris hematoxylin • 산화제 : Mercuric oxide • 핵 염색이 명확히 나타나 검사실에서 가장 많이 사용 • 퇴행성 염색으로 사용 • Mayer hematoxylin • 산화제 : Sodium iodate • 진행성 염색으로 사용되며, 특수 염색에서 핵을 대조 염색하는 경우 이용

10. Type of hematoxylin • Aluminium mordanted hematoxylin • 종류 • Delafield hematoxylin • 마개를 하고 3~5일간 빛과 공기에 노출하여 자연숙성시켜 산화시킨 후 여과 • Ehrlich hematoxylin • 2주 이상 공기중에서 산화 • Gill's hematoxylin (#1, #2, #3) • 산화제 : Sodium iodate • Carazzi's hematoxylin • 산화제 : Potassium iodate

11. Type of hematoxylin • Aluminium mordanted hematoxylin • alcohol의 기능 • 곰팡이(진균류)의 증식을 억제시키는 보존제 • Glycerol의 기능 • 과산화를 막아주며, 용액의 증발을 방지 • 빙초산(glacial acetic acid)의 기능 • 핵염색의 선택성을 증진시키고 과산화작용을 완화하며, 산화제의 기능을 촉진하여 보다 좋은 염색성을 나타내도록 하는 염색 강화제

12. Type of hematoxylin • Iron mordant hematoxylin • Alum 다음으로 핵염색에 많이 쓰이는 매염제 • Iron mordant hematoxylin 용액에 사용되는 철염(iron salt)은 산화제와 매염제의 두 작용을 공유 • Ferric chloride와 ferric ammonium sulfate가 많이 사용되며, 매염제는 철염을 함유하고 있어 강한 산화능을 소유하고 있기 때문에 종종 hematoxylin 염색의 탈색액으로 이용 • 가장 주의해야 될 것은 산화로서, 항상 매염제와 hematoxylin 용액을 분리하여 두었다가 사용 전 즉시 혼합 (Weigert's hematoxylin)하여 염색하거나 따로 분리하여 사용(Heidenhain)

13. Type of hematoxylin • Iron mordant hematoxylin • 일반 염색보다 특수염색의 핵염색에 사용되는데, 염색과정에 산성용액이 있는 경우 alum mordanted hematoxylin은 염색력이 약화되기 때문 • 종류 • Weigert iron hematoxylin • Ferric chloride를 매염제와 산화제로 동시에 사용 • 특수염색에서 더욱 좋은 결과를 나타낸다. • Heidenhain's hematoxylin • Ferric ammonium sulfate를 산화제와 매염제로 동시에 사용

14. Type of hematoxylin • Iron mordant hematoxylin • 종류 • Verhoeff's hematoxylin • 탄력섬유의 증명에 이용하며 Ferric chloride와 Lugol's iodine을 매염제와 산화제로 사용 • Tungsten hematoxylin • Tungsten (1% phosphotungstic acid)을 매염제로 사용하며, Mallory's PTAH염색에 사용 • 그 외 Loyez's, Molybdenum, Lead , Bohmer, Bullard hematoxylin 등

15. Type of hematoxylin

16. Routine staining • 감별(differentiation) • Harris hematoxylin은 퇴행성 염색법에 사용하므로 핵을 과염색한 후 1% HCl-alcohol 용액으로 감별 • alum hematoxylin은 pH가 2.95 정도이므로 acid alcohol 용액으로 분별하면 붉은색을 나타낸다. • 감별이 완료된 조직은 수돗물이나 alkali 용액(약 pH8.0) 으로 처리 - blueing. • 일반적으로 수돗물에서 충분히(10분 정도) 수세하는 방식이 좋으나 pH 8.0 ammonium hydroxide 용액이나 lithium carbonate 용액 또는 pH 8.2 Scott’stap water 등을 사용

17. Routine staining • 핵의 청화액 (blueing:중화) • Alum은 용해되면 해리되어 aluminium과 수용액 내의 –OH기가 결합하여 불용성의 aluminium hydroxide을 형성 • 수용액 내에 많은 양의 산이 존재하면 aluminium hydroxide가 형성되지 않고 OH이온의 결핍으로 인해 alum hematoxylin도 불용성의 dye lake를 형성할 수 없게 되어 산용액 내의 alum hematoxylin은 적색으로 변화 • 청색화하기 위해서는 유리 산(free acid)을 중화시킬 수 있는 hydroxyl 기 (알칼리 용액)을 첨가

18. Routine staining • 핵의 청화액 (blueing:중화) • 물에 녹지 않는 안정된 청색의 불용성의 dye lake (aluminium-hematein-tissue lake) 가 형성 • 중화제 (청화액) 로는 40~50℃의 따듯한 물, 암모니아 수용액, lithium carbonate (탄산리튬)수용액이거나 0.5% potassium 또는 sodium bicarbonate, Scott's tap water substitute(가장 우수) 등의 알칼리 용액이 사용

19. Eosin • Eosin 염색용액 (세포질 염색액) • Eosin 염색용액은 절편을 먼저 hematoxylin 용액으로 핵을 염색한 후 hematoxylin에 염색되지 않은 나머지 부분에 옅은 적색으로 염색 • 핵의 청색이 주위의 적색과 대조되어(contrast) 더욱 잘 보일 수 있도록 하기 위한 목적으로 시행하는 염색 • 세포질 염색액은 대개 산성 염료이며 조직구조의 염색은 eosin Y와 phloxine B가 주로 사용 • 사용되는 eosin Y의 농도는 0.5~2% 사이이며 RBC, muscle fiber, 세포질 등을 pinkish- red로 염색

20. Eosin • Eosin 염색용액 (세포질 염색액) • Eosin 염료 • Eosin은 산성 잔텐(acid xanthene), 프탈레인 (phtalein)계 염료로서, eosin Y, eosin B, phloxine, erythrosine의 네 종류가 있다. • 브롬(Br)원자를 4개 갖고 있어서 tetrabromo-fluorescein이라 한다. • alcohol 보다 물에 대한 용해도가 대단히 높다. • Eosin은 hematoxylin과 같은 핵염색에 대한 대조로 적합하기 때문에 대조염색 중 가장 흔히 사용되는 염료 중 하나

21. Eosin • Eosin 염색용액 (세포질 염색액) • Eosin의 염색 원리 • 산성염료인 eosin 염료분자는 수용액 내에서 음(-) 으로 하전 되어 있어서 조직 내의 양(+)으로 하전된 성분과 결합 • 단백질의 총 전하를 양(+)으로 변화시키기 위해서는 eosin 수용액의 pH를 6.0 이하로 낮춰야 하기 때문에 초산(acetic acid)를 소량 첨가하여 용액의 pH를 조절 • Eosin의 pH는 약 4.6~5.0 사이에서 가장 좋은 염색성을 나타낸다.

22. Routine staining precedure • 박절 후 paraffin ribbon을 60℃ oven에 1 시간 정도 건조시킨 다음 일반염색과정은 다음 단계를 거친다. • 탈 paraffin 과정 • 조직내부에 침투된 paraffin과 조직 외부에 포매된 paraffin을 제거하는 과정 • 주로 xylene이 사용 • 박절표본은 뿌옇게 보이는 것은 완전히 건조되지 않아 물이 xylene에 혼합되었기 때문 • 함수과정 • 고농도의 alcohol로부터 저농도의 alcohol을 단계적으로 거친 다음 수세하는 것으로 이 과정의 목적은 염색용액이 대부분 수용액 상태이기 때문

23. Routine staining precedure • 염색과정 • 탈수 및 투명과정 • 염색 후 단계적인 탈수와 xylene으로 투명 • Xylene 투명과정을 다 거치면 조직절편은 투명하게 보여야 하며, 만약 절편이 혼탁하게 보이는 것은 탈수가 불완전한 것 • 탈 paraffin에 사용했던 xylene은 용액 내에 paraffin을 함유하고 있기 때문에 봉입제의 경화작용을 방해하므로 탈수 후의 투명제로는 적합하지 않다.

25. stain jar & rack

26. Autostainer

27. Dye vs Chromogen picric acid(2,4,6 –trinitrophenol) 2,4,6-trinitrobenzene 염료(dye)와 색원체(chromogen)의 차이를 보여주는 그림이다. 두 화학적 구조의 차이는 무엇의 존재 여부에 따른 것인가? 1. 발색단 2. 조색단 3. 벤젠 4. 변색제

28. Hematoxylin(C16H14O6) Hematein(C16H12O6) 다음 중 다음 중 hematoxylin과 hematein에 대한 설명으로 틀린 것은? 1. hematoxylin은 옅은 갈색 색소이다 2. hematein은 hematoxylin의 산화물이다 3. hematein은 매염제와 결합해야 염기성염료로 작용한다 4. hematoxylin으로도 핵을 염색할 수 있다

29. HE 염색에 사용되는 자동염색기이다. 염색용기의 배열이 맞게 되어 있는 것은 ? 1. 탈파라핀 –함수-수세-핵염색-수세-세포질염색-탈수-투명-봉입 2. 탈파라핀 –탈수 –수세-핵염색-수세-세포질염색-함수-투명-봉입 3. 탈파라핀 –함수 –수세-세포질염색-수세-핵염색-탈수-투명-봉입 4. 탈파라핀 –함수 –수세-핵염색-수세-세포질염색-투명-탈수-봉입

30. HE염색을 완성한 후 조직표본 내에서 관찰된 것이다. 무엇 때문에 생긴 것인가 ? 1. 탈수 불충분2. 박절 결함 3. 기포 발생4. 자가융해

31. HE염색을 완성한 후 조직표본 내에서 관찰된 것이다. 무엇 때문에 생긴 것인가 ? 1. 헤마톡실린을 여과하지 않았을 때 2. 혈액이 많은 조직일 경우 3. 투명이 불충분할 때 4. 탈수가 불충분할 때

32. Section 1-12 Mounting 봉입

33. Mounting • 봉입의개요 • 봉입은 염색이 완료된 조직표본에 봉입제를 묻힌 cover glass로 밀착시켜 씌우는 일이며, 조직표본제작을 완성하는 마지막 단계 • 염색표본을 명확히 관찰하기 위해서 slide와 굴절률이 유사한 점도가 높고 투명한 매질을 떨어뜨린 후 cover glass를 덮어 영구보존 해야 하는데 이때 사용하는 매질을 봉입제(mounting medium)라 한다.

34. Mounting • 봉입의 의의와 기능 • 염색표본의 물리적 손상, 산화에 의한 퇴색의 방지하여 염색성에 변화를 주지 않고, • 염색의 퇴색과 조직절편의 부패를 방지하며, • 표본을 오래 투명하게 유지할 목적으로 사용되어지고 있다.

35. Mounting • 준비 기구 및 재료 • 봉입용 forcep • 여과지(filter paper) • Gauze • 봉입제, balsam병 • Slide 정돈판 (mappe) • Slide lable sticker (slide 부착용) • Cover glass • 증기 흡입기, Hume hood나 clean bench

36. Mounting • 봉입제가 갖춰야 할 조건 • 봉입제의 굴절률(refractive index)이 조직의 평균 굴절률인 1.530~1.540에 가까워야 하고 • slide 위에 부착한 조직절편과 cover glass 사이에 고르게 펴져야 하며 • 비교적 짧은 시간에 굳어져야 하고 • 무색 투명해야 하며 • 접착력이 있어야 한다. • 기포가 잘 빠져야 한다. • 염색 결과에 영향을 주어서는 안되므로 pH가 중성이 되어야 한다.

37. Mounting • 수용성 봉입제 • 지방염색 • 지방은 alcohol에 용해되므로 탈수과정 없이 봉입 • amyloid(유전분체)의 이염색성 염색, 변색성 염색 • alcohol이나 xylene 등에 의해 퇴색되며, 변색성 염색을 한 후 비수용성 봉입제로 봉입하면 염색성이 정색성으로 변화하기 때문 • 면역형광법을 이용하는 검사 • 조직 내의 효소 검출 시

38. Mounting • 수용성 봉입제 • 수용성 봉입제의 종류 • Glycerol(glycerin) • Mineral oil(liquid paraffin) • Glycerin jelly(glycerol gelatin) • 봉입 후 단단히 굳힌 후에 coverslip의 가장자리를 메뉴큐어로 잘 밀봉하여 두면 몇 년간 염색 표본의 보존이 가능 • Apathy gum syrup • Levulose(fructose) syrup

39. Mounting • 비수용성 봉입제 • 최초로 사용된 봉입제는 천연에서 생산되는 Canada balsam • 천연수지를 가공하지 않은 상태로 사용하면 봉입이 더디고 cover glass가 단단히 굳기까지 시간이 오래 걸리며, 염색된 조직이 점점 퇴색되는 등의 단점이 있다. • 수지를 원료로 하는 봉입제는 항상 xylene 등과 같은 용매로 적당한 점도를 유지시켜 사용해야 되므로 염색된 절편을 완전히 탈수하지 않으면 잘 혼합되지 않아 혼탁을 일으켜 검경을 방해

40. Mounting • 비수용성 봉입제 • 천연수지 봉입제 • 천연수지는 완전히 굳는데 2~3개월 걸리며, 오래되면 황색으로 변하고, • 용매가 증발하고 나면 균열이 발생 • 장기간 보관할 경우 천연수지에 포함되어 있는 산성성분이 염색 색조를 퇴색시키는 단점 • 종류 • Canada balsam (굴절률 1.541~1.547) • Gum dammer

41. Mounting • 비수용성 봉입제 • 합성수지(synthetic resin) 봉입제 • Synthetic resin은 대부분 중성이며 비교적 빨리 굳으며 염색표본의 장기간 보존상태가 좋다. • 주로 β-pinene polymer로 이루어졌다. • 장점 • 화학조성을 알 수 있으며 안정되고 순수하다. • 휘발성 유기용매에 쉽게 용해된다. • 색상이 투명하며, 오랜 시간이 지나도 황색변화가 발생하지 않는다. • 1 시간 이내에 건조 • 조직절편과 슬라이드의 굴절율이 동일한 굴절율을 갖는다. (Rf=1.53~1.54)

42. Mounting • 비수용성 봉입제 • 합성수지봉입제의 종류 • Eukitt : 굴절률 1.510 • Harleco synthetic resin : 굴절률 1.548 • Permount : 굴절률 1.529 • Bioloid : 굴절률 1.550 • Histoclad : 굴절률 1.560 • Caedax

43. Mounting • 봉입의 방법 • 봉입제의 양이 적으면 기포가 생기기 쉽고, 후에 봉입제가 건조되면서 공기가 들어가면 표본의 질이 떨어진다. • 봉입제의 양이 너무 많으면 봉입제가 cover glass 밖으로 새어 나와 slide가 지저분하게 되고 현미경 검경 시 뿌옇게 보이므로 이때는 여과지에 slide를 세워 여액을 흘려 보내고 xylene을 묻힌 gauze로 가장자리를 닦아낸다. • 조직표본에 xylene이 말랐을 경우 xylene에 담궈 두었다가 다시 봉입한다.

44. Mounting • 봉입의 방법 • 작은 기포들이 생겼을 때는 예리한 forcep으로 가만히 눌러 빼낸다. Forcep으로 눌러도 잘 빠지지 않는 것은 xylene 용액에 담그어 두었다가 cover glass를 떼어내고 다시 봉입한다. • 지방 염색 후 수용성 봉입제로 봉입할 때는 기포가 생겼다고 forcep으로 눌러주면 지방방울의 위치가 변할 수 있으므로 눌러서는 안된다.

45. Mounting • 봉입의 방법

46. Mounting • 봉입의 방법

47. Automatic coverslipping machine

48. 염색 후 봉입하는 과정이다. 지방 염색을 하였다면 다음 중 어떤 봉입제가 적당한가? 1. Canada balsam 2. Glycerin jelly 3. Permount 4. Caedax

49. Hematoxylin Hematein-lake Harris hematoxylin용액이다. 왼쪽은 알코올에 헤마톡실린만을 녹인 것이고 오른쪽은 매염제와 산화제를 넣어 만든 완성 용액이다. 사용된 산화제는? 1. Pot. Permanganate 2. Hydrogen peroxide 3. Sodium iodate 4. Mercuric oxide