1 / 53

Eiwitzuivering 3

Eiwitzuivering 3. Kolom chromatografie: - Gelfiltratie - ionchromatografie - affiniteitschromatografie. Sigrid Beiboer en Ivo Horn. TBEMH-P05IDB HC7. Kolom chromatografie Verschillende soorten. Een systeem. Een systeem. Chromatogram. Een kolom. Mobiele fase. Stationaire fase.

vala
Download Presentation

Eiwitzuivering 3

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Eiwitzuivering 3 Kolom chromatografie: - Gelfiltratie - ionchromatografie - affiniteitschromatografie Sigrid Beiboer en Ivo Horn TBEMH-P05IDB HC7

  2. Kolom chromatografie Verschillende soorten

  3. Een systeem

  4. Een systeem

  5. Chromatogram

  6. Een kolom Mobiele fase Stationaire fase biochemistry.wur.nl/Hb/Gelfiltratie.html

  7. Scheiding op een kolom

  8. Gedrag van moleculen in een kolom adsorptie: meer neiging tot binding aan stationaire fase Ideaal: verdeling lineair adsorptie CS desorptie: minder neiging tot binding aan stationaire fase desorptie CM Cs= concentratie is stationaire fase Cm= concentratie in mobiele fase

  9. Cs Cm Cs Cm Cs Cm Isothermen en piekvorm een juist evenwicht tussen stationaire fase en mobiele fase geeft een scherpe piek. toenemende hoeveelheid massa piekpatroon in chromatogram desorptie adsorptie

  10. CS CM K • K is de verdelingscoëfficiënt: waar bevindt zich een molecuul in de kolom, in CS of in CM • geeft de mate van verdeling over matrix en mobiele fase weer • Wet van Nernst: K = Cs/Cm K = CS/CM

  11. De “zone”; de piek • De zone is het oppervlak van de piek • De zone is rechtevenredig met de concentratie

  12. Kolom chromatografie Verschillende soorten

  13. Gelfiltratie Gelpermeatie of uitsluitingschromatografie (size exclusion chromatography) Kleine moleculen hebben meer tijd nodig

  14. De matrix voor gelfiltratie • Goede elutie eigenschappen • Hydrofiel karakter • Geen geladen groepen • Chemische resistentie • Biologische resistentie Bijv. polymeren van: • acrylamide (Biogel P) • dextraan (Sephadex) • combinatie acrylamide en dextraan (Sephacryl) • agarose (Sepharose, Biogel A)

  15. De volumina in een kolom Vc = kolom volume V0 = void volume (buitenvolume) Vi = intern volume (binnenvolume) Vm= matrix volume Ve= elutie volume Vm Vc = V0 + Vi + Vm groot eiwit: Ve=V0 klein eiwit: Ve=V0+Vi

  16. Berekeningen met gelfiltratie • Vc = V0 + Vi + Vm = kolomvolume = π r2 h, hieruit de benodigde hoogte • Kd of K0 = (Ve - V0) / Vi ; (Cs/CM), verdeling over kolom • K0: hoe groter de K0, hoe kleiner de molmassa (Mw): K0 nadert 0: groot molecuul. K nadert 1: kleinste moleculen (volledige distributie over Vi en V0)

  17. Toepassingen gelfiltratie • Isolatie en zuivering biomoleculen (H05PBM) • Molecuulmassa bepaling • Ontzouten • Bufferverwisseling

  18. Vraagje • Welke van onderstaande methoden kun je gebruiken om zout te verwijderen? • Gelfiltratie • Ultrafiltratie • Dialyse • Homogeniseren • Centrifugeren

  19. Fractieverzamelaar • Meet OD280 en geeft dit door aan recorder • Verschuift buizen in rek met bepaalde snelheid en geeft buiswisseling ook door aan recorder

  20. Zuivering mbv gelfiltratie

  21. Zuivering mbv gelfiltratie

  22. Ionchromatografie Ionenwisselaars R-Na2 + Ca2+ R-Ca + 2Na+ Zeolieten: - natuurlijke ionenwisselaars - aluminiumsilicaten

  23. Principe scheiding

  24. Matrix Spacer arm Ligand Biomolecuul Matrix en spacer arms Matrix: - onoplosbaar - chemische resistent - biologische resistent - inert - capaciteit Spacer arm vaak voor biochemische toepassingen tegengaan sterische hindering

  25. Ionogene groepen • Kationenwisselaar: - bevat negatief geladen / zure groepen (bv. Dowex-50, CM cellulose, Chelex-100) - uitwisseling positievekationen • Anionenwisselaar: - bevat positief geladen / basische groepen (bv. Dowex-1, DEAE) - uitwisseling negatieve anionen

  26. Toepassingen voor water • Ontharding van water: kalk, Ca2+ Na+ • Demineralisering van water: - verwijdering kat- en anionen - 2 ionenwisselaars (indien gemengd: mixed bed) - kationen worden vervangen door protonen - anionen worden vervangen door OH--ionen Op lab: • demiwater, gedemineraliseerd water mbv hars kolom, vergelijkbaar met enkelvoudig gedestilleerd water • mQ of milliQ water, gedemineraliseerd water mbv Millipore kolom, soort “bidest”

  27. Toepassingen voor eiwitten Eiwitlading pH hoog pH laag pH neutraal Neutrale a.z. 0 0 0 Basische a.z. 0 + n+ Zure a.z. - 0 m- Netto lading - + n-m Isoëlektrisch punt (IEP): • pH waarbij de nettolading van het eiwit nul is • kan bepaald worden met isoëlektrische focussering

  28. Hoe werkt ionchromatografie bij eiwitzuivering? pH boven IEP, eiwit is negatief anionenwisselaar pH beneden IEP, eiwit is positief kationenwisselaar pH en ionsterkte bepalen affiniteit eiwit voor kolom Grotere afwijking pH van IEP grotere affiniteit

  29. Elutie pH wijzigen of ionsterkte verhogen [NaCl]=0 [NaCl]=1 M Buffer en pH blijven gelijk in zoutgradiënt, alleen zoutconcentratie stijgt!

  30. Ionchromatografie van aminozuren

  31. Zuivering mbv ionchromatografie

  32. Affiniteitschromatografie Zuivering gebaseerd op biologische functie of individuele structuur

  33. Scheidingsprocedure

  34. Affiniteit De mate van aantrekking van moleculen reversibel, dus niet covalent!

  35. Affiniteitschromatografie Mobiele fase Stationaire fase Schone uitloop

  36. Schema affiniteitschromatografie

  37. Matrix Spacer arm Ligand Biomolecuul

  38. Matrix • Inert • Open structuur toegankelijk voor eiwitten om aan ligand aan matrix te kunnen binden • Groot aantal chemische groepen, waaraan ligand covalent gekoppeld kan worden • Goede elutie eigenschappen • Chemische stabiliteit

  39. Voorbeelden matrix • Agarosekorrels • Polyacrylamide korrels • Poreuze glazen korrels • Grote bolvormige korrels: geven interkorrel ruimtes, die geschikt zijn voor AC van grote biomoleculen zoals ribosomen, membraanfracties en zelfs intacte cellen!

  40. Ligand • Specifieke, reversibele affiniteit voor biomolecuul • Bezit minstens één reactieve groep voor binding aan matrix mag niet betrokken zijn bij biologische herkenning! • Oplosbaar in vloeistoffen betrokken bij koppelingsproces en bestand tegen koppelingsreacties • Bindingsaffiniteit voor biomolecuul: • niet te sterk • niet te zwak • aanwezig na koppeling aan matrix

  41. Matrix Spacer arm Ligand Biomolecuul Spacer arms • Tegen sterische hindering • Fysisch-chemische eigenschappen van spacer arms beïnvloeden karakter matrix en affiniteit van biomolecuul voor ligand Hydrofobe spacer arms: toename aspecifieke binding Tegengaan door klein beetje organisch oplosmiddel in eluens of hydrofiele spacer arm

  42. Voorbeelden spacer arms

  43. Niet selectieve elutie Verandering van: • pH • Ionsterkte Pas op voor denaturatie biomolecuul!!

  44. AC voor IgG-antilichamen IgG antilichamen zuiveren met Protein-A, -G of -L affiniteitschromatografie

  45. Biotine Hoge affiniteit voor streptavidine en avidine Eiwitten zijn makkelijk te biotinyleren

  46. Biotine gebruikt om het ligand aan de matrix te koppelen

  47. Zuivering biotine-bindende eiwitten

  48. Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) Zuivering van recombinant histidine gemerkte (His-tagged) eiwitten Histidine: • pK is 6,5 • heeft imidazole ring

  49. IMAC Interactie tussen twee naburige His-aminozuren in de 6xHis-tag en de Ni-NTA-matrix.

More Related