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疑难血型鉴定

疑难血型鉴定. 南昌市血站输血研究室 徐 晶. 一、 ABO 正反定型不符问题及措施. （一） ABO 定型问题经常发生情况： 1. 明显缺失应该出现的抗 - A 或抗 - B ： (1) 新生儿血样 (2) 免疫缺陷、免疫紊乱 (3) 前带现象 (4) 血型物质过多 (5) 抗原太弱，常规方法检查不出来，相应血清中无抗体 (6) 亚型，反应是 混合视野 2. 由于试剂被污染，或试剂中有额外抗体 3. 明显多出抗原 ( 或多出抗体 ) (1) 亚型如 A2 型可能血清中有抗 - A1 (2) 自身凝集 (3) 获得性 B.

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疑难血型鉴定

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  1. 疑难血型鉴定 南昌市血站输血研究室 徐 晶

  2. 一、ABO正反定型不符问题及措施 （一）ABO定型问题经常发生情况：1.明显缺失应该出现的抗-A或抗-B：(1) 新生儿血样(2) 免疫缺陷、免疫紊乱(3) 前带现象(4) 血型物质过多(5) 抗原太弱，常规方法检查不出来，相应血清中无抗体(6) 亚型，反应是混合视野2.由于试剂被污染，或试剂中有额外抗体3.明显多出抗原(或多出抗体)(1) 亚型如A2型可能血清中有抗-A1(2) 自身凝集(3) 获得性B

  3. （二）引起ABO正反定型不一致的原因分析 1.技术因素： 2.存在IgM性质的自身冷抗体 在低于37℃时血细胞自身凝集，影响正反定型。可用DTT或2-Me来处理细胞及血清来解除此种IgM抗体引起的干扰。血清的反定型可在37℃进行，用O型红细胞作为对照。 3.抗原表达弱或缺失： (1) A、B抗原的表达可在下述情况下被抑制：a.白血病;b.双胞胎;c.H基因变异 (2) A、B抗原表达太弱：由于A、B抗原表达太弱，与抗-A或抗-B不反应，但确实存在A或B抗原，因此血清中无相应的抗体。

  4. 4.高水平可溶性血型物质的病人： 极少数有卵巢囊肿的妇女，由于含高浓度可溶性血型物质，使抗原减弱或消失，此血型物质可中和抗-A或抗-B。当使用未洗涤的RBC用于ABO 定型时，血型物质就会中和抗-A或抗-B，引起假阴性反应。5.混合视野：(1) 来自近期输注非ABO同型红细胞病人的血样(2) 骨髓移植后不久(3) Tn或A3型红细胞6.缺失或弱抗-A、抗-B(1) 新生儿血清(2) 免疫缺陷、紊乱病人(3) 老年人

  5. 7.前带现象 当抗-A或抗-B的效价IgG太高时, 立即离心法与A 或B细胞不反应。解决方法：(1) EDTA抗凝血浆结合钙(2) 使用EDTA保存液悬浮细胞(3) 将血浆于56℃灭活补体(4) 血浆或血清用盐水1:10稀释8.多凝集： 多凝集红细胞，具有不正常的膜结构，可被正常成人血清凝集。起因是微生物酶引起膜的改变，以及膜上糖基合成不完善。9.不正常血清蛋白： 白蛋白/球蛋白比例失调的血清引起红细胞产生缗钱状假凝集。10.血样血清中存在抗试剂成分的抗体： 如抗防腐剂的抗体、抗EDTA的抗体等，此种抗体可以通过将红细胞洗涤而解除。

  6. 二、解决ABO定型不一致的指导原则 • （一）出现弱反应或缺失抗原的解决方案 • 洗涤RBC且延长孵育时间，反应加强，则考虑是型物质抑制 • 酶处理红细胞再次试验 • 吸收放散确定是否是亚型 • 了解输血史(尤其是O型红细胞输注)来分析混合视野 • 了解病情诊断（尤其是白血病） • 了解是否是骨髓移植受者 • 了解是否是双胞胎 • 是否使用从前未使用过的单克隆抗体血清进行了血型鉴定 • 分泌型型物质检查 • 进行玫瑰花试验来确定是否混入其它红细胞，或进行细胞分离 • 如果是弱A或弱B遗传，则检查红细胞上H抗原的表达

  7. （二）出现弱反应或缺失抗体的解决措施 • 延长反应时间 • 于室温及4℃检查血清中的抗体。用A、B、O及自身红细胞进行检查 • 于室温及4℃检查血清中抗体。用酶处理的A、B、O及自身细胞进行检查。可能需要在试验前进行冷抗体的自身吸收 • 确定病人年龄及临床诊断（如新生儿、免疫病） • 确定输血史（非ABO同型的血浆输注）

  8. （三）出现多余抗原（额外抗原）的解决方案 • 将红细胞洗涤再进行试验，确定是否病人或献血员血清存在针对ABO定型试剂成分抗体 • 用O型及自家红细胞于室温检查病人血清，确定血清中否有冷自身抗体，如有则用2Me或DTT处理。 • 用不同厂家的试剂检查洗涤的红细胞 • 了解病人的临床诊断 • 如果怀疑是获得性B，则用酸化的抗-B检查 • 进行ABH分泌型型物质检查 • 如果用多克隆抗-A检查结果是混合视野，则用蛋白酶处理RBC试验，考虑是否是多凝集

  9. （四）出现额外抗体： • 于室温及4℃检查，确定是否存在自身抗体或冷同种抗体 • 洗涤红细胞再次进行试验，防止血清中有针对试剂红细胞保存液成分的抗体

  10. （五）混合视野凝集的解决方案 • 确定是否近期怀孕或输血 • 确定临床诊断（尤其是白血病） • 是否是骨髓移植受者 • 是否是双胞胎 • 用细胞分离术将两群细胞分开，分别定型 • ABH型物质检查 • 了解输血史

  11. 三、ABO正反定型不符合处理办法 ABO正反定型不符时（不规则抗体或ABO亚型血所致）排除方法： 1.置室温5分钟～1小时，使弱反应增强。 2.作抗体筛检。 3.吸收放散试验。 4.ABO亚型检测

  12. 血型 红细胞抗原 血清中抗体 唾液中抗原 血清中B转化酶 anti-A anti-B anti-A,B anti-H 常见 罕见 A 4+ 0 4+ 1+ anti-B 无 A ,H 阳性pH = 6 A2 3+ 0 3+ 3+ anti-B anti-A11~8% A ,H 阳性pH = 7 A3 2+mf 0 2+mf 3+ anti-B 少见anti-A1 A ,H 弱阳性 AX ±/0 0 2+ 4+ anti-B 定见anti-A1 H 极弱阳性 Am 0 0 0 4+ anti-B 无 A ,H 阳性 Ael 0 0 0 4+ anti-B 常有anti-A1有时也有anti-A H 阴性 各种A型 mf =混合反应；±= 弱反应；0 = 无反应；* = 以吸收放散试验才能证明有

  13. 血型 红细胞上抗原 血清中抗体 唾液中抗原 血清中B转化酶 anti-A anti-B anti-A,B anti-H 常见 罕见 B 0 4+ 4+ 2+ anti-A 无 B ,H 阳性 B3 0 2+mf 3+mf 4+ anti-A 少见弱anti-B B ,H 弱阳性 BX 0 1+ 2+ 4+ anti-A 常见弱anti-B H(B) 阴性 Bm 0 +/- 1+ 4+ anti-A 无 B ,H 弱阳性 Bel 0 0 0 4+ anti-A 有时弱anti-B H 阴性 各种型B型 mf = mixed field混合反应；0 = 无反应；( )量减少

  14. 孟买血型及类孟买血型 血型名称 红细胞抗原反应 血清抗体反应 唾液抗原反应 anti-A anti-B anti-A,B anti-H A cell B cell O cell A B H 孟 买 型 Oh OhA OhB OhAB Ah Bh ABh - w+/- - w+/- - - w+/- w+/- - w+/- w+/- w+/- - - - - + + + + + + + + + + + + - - - - - - - - - - - - 亚 孟 买 型 OHm AHm BHm ABHm - w+/- - w+/- - - w+/- w+/- - w+/- w+/- w+/- - - - - + + + + + + + + + + + + - + - + - - + + + + + +

  15. O型血正反定型不附及解决办法 正定型 反定型 血 型 矛盾原因 解决办法 anti-A anti-B anti-A,B A cell B cell O cell - - - - + + - - - - + + - - - - + + - + - - + + - - + + + + - - - - + + O O O O O O 丙型球蛋白过低 丙型球蛋白过低 丙型球蛋白过低 血癌,A抗原可能消失 有特异或非特异性抗体 缗钱,细菌污染,多凝集性 重测血清分型(18℃) 重测血清分型(18℃) 重测血清分型(18℃) 重测血球及血清分型 不能解决 不能解决

  16. A型血矛盾的原因及解决的办法 正定型 反定型 血 型 矛盾原因 解决办法 anti-A anti-B anti-A,B A cell B cell O cell + + + + - - - - - + - - - - - - + + + + + + + + - - + + + - - + - + + + + + + + - - - + - - + + A A A2 A/A2 A/O O O O 丙型球蛋白过低 后天性获得B抗原 含有抗A1的A亚型 有特异或非特异抗体 含有抗A1的A亚型 A亚型 A亚型有特异性抗体 A亚型有非特异抗体 重测血清分型(18℃) 可能为肠道疾病 重测血球与Lectin- A1 抗体鉴定试验 测A1,A2血清分型 唾液试验 抗体鉴定试验 抗体鉴定试验

  17. 正定型 反定型 血 型 矛盾原因 解决办法 anti-A anti-B anti-A,B A cell B cell O cell - - - + + + + + + + + + + + + + + + - + - - + + - + + + - - - + + + - - B B B AB A2B AB/A2B 丙型球蛋白过低 特异或非特异抗体 特异或非特异抗体 血清有特异性抗体 含有抗A1的A2B型 血清有特异性抗A1 重测血清分型(18℃) 抗体鉴定试验 抗体鉴定试验 抗体鉴定试验 重测RBC与Lectin A1 抗体鉴定试验 B型及AB型血矛盾的原因及解决的办法

  18. 四、ABO 血型分型不合处理步骤流程 ABO血球分型有某抗原反应较弱，但结果与血清分型吻合 (1).可能原因为： a.A或B亚型 b.H血型物质缺乏（如Ahm或Ah等） c.疾病造成血型抗原表现减弱 d.有两种血球族群存在（chimeras或病人输入大量其它血型之血球，如O型血球等）。

  19. (2).处理方法为： a.排除两种血球族群存在方法是测定病患血球各种血型抗原之表现型，视其结果是否同ABO血球分型，有较弱抗原反应 b.使用单株抗体，视其反应是否增强 c.对照亚型分型表，找出是否符合某种亚型分型 d.以吸附及冲出试验确定A及B抗原之存在 e.注意mixed-field反应

  20. ABO血球分型有某抗原反应较正常弱，但结果与血清分型不合ABO血球分型有某抗原反应较正常弱，但结果与血清分型不合 (1)可能原因为： a.A或B的亚型血清中有allo anti-A1或anti-B b.血球有多重凝集(polyagglutinability) c.自体抗体覆盖于测试之血球上 d.抗血清试剂中具有对抗血球上低频率抗原之抗体 e.单株之anti-A(anti-B)抗体检测出B(A)表现型

  21. ABO血球分型正常，但血清分型有异常阳性反应时，ABO血球分型正常，但血清分型有异常阳性反应时， (1).可能原因为： a.病人血清中有自体或异体抗体(allo- or autoantibody) b.因输血或器官移植被动性获得之抗体(passive acquired antibody) c.有对抗试剂红血球稀释液之抗体 (2).处理方法为：以另外的A或B红血球测试，同时与抗体普检及交叉试验一起判读，应该不难找出原因。

  22. ABO血球分型正常，但血清分型反应较弱或呈阴性反应时，可能原因为：ABO血球分型正常，但血清分型反应较弱或呈阴性反应时，可能原因为： a.因年纪、疾病或遗传造成血清中anti-A或-B浓度较低 b.某些情况下抗体浓度太高(prozoning)或Ael、Bel血球分型呈O型，但相对的anti-A或B消失。

  23. 五、不规则抗体筛检 目的： 测试病人、献血员、怀孕妇人产前的血清，是否含有不规则抗体，以预防输血时或输血后，进而发生输血反应。

  24. 国际先进做法 国内目前做法 病 人 献血者 病 人 献血者 血 型 血 型 血 型 血 型 抗体筛选 抗体筛选 交叉配血 阳性 阴性 阴性 阳性 电脑核对 抗体筛选 抗体鉴定 发血 交叉配血 选择特殊献血者

  25. （一） 提前一步： • 不需要供血来进行实验，有利于早期发现和确认具有临床意义的不完全抗体，并可以在配血前鉴定此不完全抗体，获得充足的时间来选择缺少相应抗原的相配合的血，避免由于寻找不到相合的血液而造成患者病情的延误

  26. (二) 节省资源： • 节省人力资源，抗筛阴性的病人可以直接用计算机核对血型后发血，而不需要交叉配血，减少交叉配血的劳动量，极大降低了输血科的人力劳动量，输血科医师有更多的时间开展其它工作保证输血的安全； • 抗筛方法使用标准红细胞，相对交叉配血减少了由于无临床意义抗体和抗原导致的红细胞凝集，减少了无意义的输血不合，降低了输血科的工作量。

  27. （三）节约血源： • 病人抗筛结果阴性时，只要用计算机核对血型即可发血。不用为特定病人指定专门用血，可实现病人间共享血源； • 由于病人的血源可以共享，减少了血液的库存。

  28. （四）经济省钱： • 很多需要输血的病人都不止输一袋血。如交叉配血须每单位收费一次，而抗筛只需进行一次； • 若病人反复输血，进行抗筛不必每天抽取血样。每72小时检测一次病人是否有不规则抗体生成，被认为是实用而且安全的。

  29. （ DAT：阳性） P1 P2 P3 P4 P5 P6 LISS/Coombs卡 何时做该试验？

  30. P4 抗体种类鉴定卡I 取 DAT阳性血液做如下试验：

  31. （1）结果：含IgG类抗体

  32. 温抗体型自身免疫性 溶血性贫血 （3）意义：有助于确定不同的抗体种类 WAIHA患者，通常有IgG类抗体包被其红细胞； 约24%的WAIHA患者， 也可能同时检测出C3补体； 更少见的情况是，约7%的WAIHA患者仅显示红细胞上有补体； 也可能存在抗- M 和/或抗-A抗体。

  33. 冷凝集素病（Cold Agglutinin Disease） CAD患者，通常只检测到补体包被其红细胞，但也可能同时检测到抗- M 和/或抗-A抗体；

  34. 判读一 判读二 I II Auto I II Auto MP - - - + + + AHG - - - - - - Coomb's cell 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 表示不规则抗体筛检为阴性反应。 应怀疑有冷凝集素的干扰或是缗钱状反应的干扰 六、手工凝聚胺法(manual polybrene method)之判读

  35. 判读三 判读四 I II Auto I II Auto MP +/- +/- + +/- +/- - AHG +/- +/- + +/- +/- - Coomb's cell -/2+ -/2+ - -/2+ -/2+ 2+ 应怀疑有自体抗体的干扰。 AC(-)，而I、II其中有一管或均为(+)时，表示有不规则抗体的存在。

  36. 七、问题排除 • 当3管在MP方法下为(+)反应，而在37℃或AHGphase为(-)： • 如怀疑是冷凝集素的干扰，可加作于4℃的反应，将screen I、II及AC管各滴入血球悬浮液后，加入病人血清2滴，混合均匀，放于4℃冰箱中5~10分钟，离心3400rpm，15秒，如有凝集反应则可确定是冷凝集素。 • 若怀疑是缗钱状反应的干扰时，可把病人血球1滴，加病人血清2滴，加入生理食盐水离心15秒，凝集应该会散开。或是将病人血球1滴加血清1滴，于载玻片上混合均匀，加入1滴生理食盐水于显微镜下观察，凝集也会慢慢散开。

  37. 当Auto control为阳性反应时，应怀疑是自体抗体的干扰，重新采取病人检体，做冲出及吸附试验。 • 当Auto control为阴性反应，而screen I、II其中有一管或均为阳性反应时，可在抗体筛检表格当中对照出几种可能的抗体，重新采取病人检体做不规则抗体鉴定试验。

  38. 八、不规则抗体鉴定 分析原理： 利用8~11种不同的细胞组(Panel cell)，当作血型之抗原，再加入病人本身红血球作为自体对照(Auto-control)，与病人的血清反应，结果将与鉴定表格以排除法(rule out)鉴定出相对应的不规则抗体。可采用手工凝聚胺法或微柱凝胶法。

  39. 利用删除法来找出正确的不规则抗体种类 先从0的反应开始删除，阴性反应之抗体先删除，最后未被删除的及可能是我们要找的结果；有时候结果并不一定只有1个相对应的抗体。

  40. D C E c e K k M N S s JKa JKb IS 370C AHG 1 + + 0 0 + 0 + + 0 + 0 0 + 0 0 0 2 + + 0 0 + + + 0 + 0 + + + 0 0 0 3 + 0 + + 0 0 + + + + 0 0 + 0 2+ 2+ 4 + 0 0 + + 0 + 0 + 0 + + + 0 0 0 5 0 + 0 + + 0 + + + + + + 0 0 0 0 6 0 0 + + + + + 0 + 0 + + 0 0 2+ 2+ 7 0 0 0 + + + + + + 0 + + + 0 0 0 8 0 0 0 + + 0 + + 0 + 0 + + 0 0 0 9 0 0 0 + + 0 + 0 + 0 + + 0 0 0 0 10 0 0 0 + + 0 + + 0 0 + 0 + 0 0 0 11 + + 0 0 + 0 + + 0 + 0 + + 0 0 0 AC 0 0 0

  41. 九、抗体筛选方法 1、原则：排除原则，即阴性排阳性而不能阳性排阴性 被检血清+某一标准RBC（含X，Y抗原） 如凝集（+）：不能肯定是含抗X，抗Y，抗X+Y还是抗X，Y以外的抗体 如不凝集（-）：肯定不含针对X，Y抗原的抗体 使用一组标准细胞鉴定未知抗体特异性，基于此原则

  42. 2、筛选细胞 • （1）标准细胞配组（谱细胞） 标准细胞配组的选择原则是使用最少量细胞，但能鉴定出最多的特异性 细胞配组鉴定抗体的能力取决于： a.该配组包括的抗原有多少 b.这些抗原分布情况，是否提供足够信息 c.抗原“合理搭配”

  43. (2)简易方法 随机取3-5个O型（无ABO抗原）RBC混合“假设”所有血型抗原都互补 注意：太少——可能某抗原均阴性 太多——某抗原呈阳性，但被“稀释” 洗涤，配成3-5%悬液筛选细胞 受检血清+筛选细胞：盐水、聚凝胺、抗人球、 酶…… 凝集 抗体特异性鉴定

  44. 表1 一份未知抗体的鉴定结果 标准细胞 与标准抗血清反应 受检血清与 No.ABO型 C c D E e M N S s P1 标准细胞反应 1 O + -- + -- + -- + + + + -- 2 O -- + + + -- -- + -- + + -- 3 O + -- + -- + + + + + -- + 4 O -- + + -- + -- + + + -- -- 5 O + + -- -- + + -- -- + + + 6 O -- + -- + + + -- + -- -- + 7 O + + -- + + -- + + + + -- 8 O -- + -- -- + -- + -- + + --

  45. 结果： 受检血清与1，2号细胞反应，排除针对C，c，D，E，e，N，S，s， P1抗原的抗体，与3，5，6细胞为阳性反应，证明含有抗M抗体

  46. 十、抗体鉴定（谱细胞搭配合理）可靠性分析 被检血清反应 谱细胞某抗原 合计 + -- + A B A+B -- C D C+D 合计 A+C B+D N=A+B+C+D

  47. (A+B)!(C+D)!(A+C)!(B+D)! P= A!B!C!D!N! P<1/20，可靠性>95% P>1/20，可靠性<95%

  48. 例1 血清反应 E抗原 合计 + -- + 9 0 9 -- 0 1 1 合计 9 1 10 9!1!9!1! P= =1/10>1/20，可靠性<95% 9!0!0!1!10! 不可靠，不能排除针对E抗原抗体

  49. 例2 见表1结果 血清反应 M抗原 合计 + -- + 3 0 3 -- 0 5 5 合计 3 5 N=8 3！5！3！5！ P= =1/50<1/20，可靠性 9！0！0！1！10！ >95% 结论：血清中含抗M抗体

  50. 十二、交叉配合试验 交叉试验不能保证红血球能正常生存于受血者体内，亦不能避免所有输血的不良反应。交叉试验无法检出所有未知的抗体，但能检测ABO分型法的主要错误，及受血者血清与给血者红血球上抗原发生反应的抗体。

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