Короткевич Екатерина Юрьевна Новосибирский государственный университет

1. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ МОРФОЛОГИЧЕСКИЙ И МОРФОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ КЛЕТОК, ФИБРОБЛАСТОВ РАЗЛИЧНОЙ ПЛОИДНОСТИ И СТАБИЛЬНЫХ ГИБРИДОВ, ПОЛУЧЕННЫХ ИХ СЛИЯНИЕМ Короткевич Екатерина Юрьевна Новосибирский государственный университет Научный руководитель: к.б.н., в.н.с. Киселева Е.В. Институт цитологии и генетики СО РАН 2010 г.

2. Цель: выявить особенности структурной организации гибридных клеток, полученных при слиянии эмбриональных стволовых и дифференцированных клеток мыши, а также сравнить строение плюрипотентных клеток мыши в условиях in vivoи in vitro. Задачи: Провести морфологический анализ эмбриональных стволовых клеток линии E14Tg2aSc4TP6.3, полученной из мышей 129/Ola Mus musculus, и сравнить их с клетками предимплантационных эмбрионов (от зиготы до бластоцисты) для оценки влияния культивирования на ультраструктуру клеток ВКМ. Изучить морфологию ди- и тетраплоидных фибробластов мыши линии DD/c и сравнить их структурную организацию. Сравнить ультраструктуру двух типов стабильных гибридов, полученных в результате слияния ЭСК и ди- или тетраплоидных фибробластов мыши, с родительскими клетками для выявления особенностей реорганизации клеток при взаимодействии геномов плюрипотентной и дифференцированной клеток. Провести сравнительный морфометрический анализ ядерно-цитоплазматического отношения и поверхностно-объемного отношения ядер в плюрипотентных, дифференцированных и гибридных клетках для получения количественной информации об организации клеток с различной степенью дифференцировки.

3. ДФМ ВКМ ... ..?.. ЭСК-подобный гибрид ЭСК Зигота Бластоциста Фибробласто-подобный гибрид ТФМ 4. Провести сравнительный морфометрический анализ ядерно-цитоплазматического отношения и поверхностно-объемного отношения ядер в плюрипотентных, дифференцированных и гибридных клетках для получения количественной информации об организации клеток с различной степенью дифференцировки. 2. Изучить морфологию ди- и тетраплоидных фибробластов мыши линии DD/c и сравнить их структурную организацию. 1. Провести морфологический анализ эмбриональных стволовых клеток линии E14Tg2aSc4TP6.3, полученной из мышей 129/Ola Mus musculus, и сравнить их с клетками предимплантационных эмбрионов (от зиготы до бластоцисты) для оценки влияния культивирования на строение клеток ВКМ. 3. Сравнить ультраструктуру двух типов стабильных гибридов, полученных в результате слияния ЭСК и ди- или тетраплоидных фибробластов мыши, с родительскими клетками с целью выявления особенностей реорганизации клеток при взаимодействии геномов плюрипотентной и дифференцированной клеток.

4. Материалы и методы Клеточные культуры и ранние эмбрионы мыши: ЭСК – эмбриональные стволовые клетки (линия E14Tg2aSc4TP6.3, получена из мышей 129/Ola Mus musculus) (Pratt, 2000); ДФМ – диплоидные эмбриональные фибробласты (получены из 12.5-дневных эмбрионов мышей линии DD/c Mus musculus); tDD– тетраплоидные фибробласты (получены из ДФМ); tef4 – стабильные гибридные клетки (17 пассажей), полученные при слиянии ЭСК и ДФМ (Круглова, 2008); tef-t8 – стабильные гибридные клетки (28 пассажей), полученные при слиянии ЭСК и ТФМ (Круглова, 2008); эмбрионы – получены из мышей линии 129/Ola (стадия зиготы, 2-х и 4-х клеточного зародыша, морулы, блатоцисты). Используемые в работе клеточные культуры и эмбрионы были любезно предоставлены сотрудниками лаборатории генетики развития ИЦиГ СО РАН к.б.н., н.с. А.А. Кругловой и к.б.н., с.н.с. Е.А. Кизиловой, соответственно. Методы исследования: -Световая микроскопия полутонких срезов -Просвечивающая электронная микроскопия -Морфометрический анализ

5. Особенности организации эмбриональных стволовых клеток В А Я М Яд Яд 10 мкм Б Я М 50 мкм 2 мкм Световая микроскопия Окраска метиленовым синим Электронная микроскопия

6. Особенности ультраструктурной организации митохондрий в эмбриональных стволовых клетках А Б Впервые обнаружено, что ЭСК могут отличаться по морфологии митохондрий.В цитоплазме одних клеток присутствуют митохондрии со светлым матриксом и узкими кристами (Рис. А), в то время как цитоплазма других клеток содержит митохондрии с темным матриксом и расширенными кристами (Рис. Б). Наряду с этим встречаются клетки, в которых присутствуют оба типа митохондрий (Рис. В). М Я М М М В М М ЭПР Масштаб 1 мкм

7. Стадии раннего эмбрионального развития мыши Дробление Морула Бластоциста Зигота 2-кл 4-кл 20 мкм 1 мкм

8. Сравнительный морфологический анализ ЭСК и клеток внутренней клеточной массы бластоцисты Яд Я Яд Я М М 5 мкм 5 мкм К М Ф М ЭПР Л М ЭПР М Ф 1 мкм 1 мкм Фрагменты ЭСК Фрагменты клеток ВКМ

9. Сравнительный морфологический анализ ЭСК, диплоидных фибробластов (ДФМ) и тетраплоидных фибробластов мыши (ТФМ), а также стабильных гибридов, полученных в результате слияния ЭСК с ДФМ, ЭСК с ТФМ. Диплоидные фибробласты: Вытянутая форма, сглаженная ядерная оболочка, высокая плотность органелл в цитоплазме, расширенные цистерны ЭПР, микрофиламенты под плазмолеммой Эмбриональные стволовые клетки: округлая форма, крупное слегка изрезанное ядро, низкая плотность органелл в цитоплазме, узкие цистерны ЭПР Тетраплоидные фибробласты: вытянутая форма, сглаженная ядерная оболочка, высокая плотность органелл в цитоплазме, расширенные цистерны ЭПР, микрофиламенты под плазмалеммой Фибробластоподобные гибриды: вытянутая форма, глубокие узкие инвагинации ядерной оболочки, высокая плотность органелл в цитоплазме, расширенные цистерны ЭПР, микрофиламенты под плазмалеммой ЭСК-подобные гибриды: округлая форма, крупное ядро, высокая изрезанность ядерной оболочки, низкая плотность органелл в цитоплазме, узкие цистерны ЭПР Масштаб 20 мкм

10. Особенности ультраструктурной организации фибробластов мыши в культуре М ЭПР М Яд Я 0,5 мкм ЭПР 5 мкм 0,5 мкм

11. Сравнительный морфологический анализ ЭСК и гибридов, полученных слияниемЭСК с диплоидными фибробластами М Я Я Яд Яд Эмбриональная стволовая клетка ЭСК-подобный гибрид Масштаб 5 мкм

12. Сравнительный морфологический анализ фибробластов и гибридов, полученных слиянием ЭСКс тетраплоидными фибробластами 29 % Я Яд Я Фрагмент фибробласта Фрагмент фибробласто-подобного гибрида Масштаб 5 мкм

13. Морфометрический анализ ядерно-цитоплазматического соотношения в гибридных и исходных клетках Ядерно-цитоплазматическое отношение – отношение площади ядра к площади всей клетки на срезе, проходящем через середину ядра. Анализ клеток на полутонких срезах проводился с использованием программы AxioVision. * * * Ядерно-цитоплазматический индекс Площадь ядра, мкм2 Площадь клетки, мкм2 Ядерно-цитоплазматические отношения Средняя площадь ядра на срезе Средняя площадь клетки на срезе

14. Морфометрический анализ поверхностно-объемного отношения ядер гибридных и исходных клеток * * Поверхностно-объемное отношение, мкм2/мкм3 Поверхностно-объемное отношение, мкм2/мкм3 Поверхностно-объемное отношение (отношение площади поверхности ядра к его объему) оценивали с помощью тестовой системы линий (открытая квадратная решетка), накладываемой случайным образом на срез клетки, проходящий через середину ядра (Груздев, А.Д.; Weible, E.R., 1969)

15. Выводы ЭСКсущественноотличаются от клеток ВКМ бластоцисты по строению эндоплазматического ретикулума, отсутствию гранулярных и кристаллических включений, пучков фибрилл в цитоплазме и типу межклеточных контактов. В длительно культивируемых ЭКС мыши впервые обнаружен новый тип митохондрий, который не похож ни на один из многочисленных видов гетерогенной по морфологии популяции митохондрий ВКМ. Тетраплоидные фибробласты сходны по ультраструктурной организации с диплоидными фибробластами и отличается от них несколько большими размерами клетки и ядра. Гибридные клетки, полученные при слиянии ЭСК и диплоидных фибробластов, имеют сходную структурную организацию с ЭСК, тогда как гибридные клетки, полученные слиянием ЭСК и тетраплоидных фибробластов, сходны по морфологии с фибробластами. Оба типа гибридов характеризуются более высокой по сравнению с исходными родительскими клетками изрезанностью ядерной оболочки, к внутренней мембране которой прикрепляется компактный гетерохроматин. Сходство гибридных клеток по морфологическим и морфометрическим параметрам с ЭСК либо фибробластами скорее обусловлено плоидностью соматического партнера.