Микрочиповые системы для молекулярно-генетического анализа

1. Микрочиповые системы для молекулярно-генетического анализа Сляднев М.Н. специальность 02.00.02 аналитическая химия Научный консультант: проф.Москвин Л.Н., д.х.н. Санкт-Петербург - 2014

2. Микрочиповые аналитические системы 2 Микрочипы – миниатюрные устройства планарной геометрии, в которых создана разветвлённая сеть микроканалов и микрореакторов, предназначенная для проведения аналитических операций в микрофлюидных потоках жидкости или в стационарных реакционных объёмах. • ДОСТОИНСТВА МИКРОЧИПОВЫХ АНАЛИТИЧЕСКИХ СИСТЕМ: • Сокращение расхода проб и реагентов • Возможность интеграции нескольких стадий анализа в одном устройстве • Ускорение протекания процессов теплопереноса и массопереноса • Возможность параллельного анализа нескольких образцов • Перспективы создания портативных аналитических приборов • Высокая воспроизводимость микрочипов при массовом производстве Стеклянный чип Изучение кинетики реакций Стеклянный чип ИФА Кремниевые чипы Пробоподготовка Полимерный чип ПЦР

3. Микрочиповые аналитические системы 3 • для исследовательских задач • Высокая производительность (>1000 образцов) • Мультиплексная ПЦР-РВ • Минимальные пределы обнаружения • Низкое быстродействие • Высокая стоимость микрочипа • Необходимость отмывки при многоразовом использовании • Сложность ввода проб в микрореактор • Частичная лиофилизация ПЦР-реактивов • для экспрессного анализа • Высокое быстродействие • Малая производительность (1-5 образцов) • Высокая стоимость микрочипа • Не реализована мультиплексная ПЦР • Сложность ввода проб в микрореактор • Не реализована лиофилизация ПЦР-реактивов ü ü û û

4. Микрочиповые аналитические системы 4

5. 5 Цель работы Разработка методологии молекулярно-генетического анализа в микрочиповых аналитических системах, выбор и обоснование принципиальных схем микрочиповых анализаторов, удовлетворяющих требованиям аналитической практики: высокочувстви-тельному, воспроизводимому и экспрессному определению нуклеиновых кислот, и подтверждение их работоспособности на модельных и реальных пробах

6. 6 Задачи Обосновать схемы и выбрать необходимые условия осуществления реакций молекулярно-генетического анализа в микрочиповых аналитических системах. Выбрать материал, обеспечивающий выполнение условий проведения аналитических реакций и выявить основные закономерности влияния его характеристик на проведение ПЦР в микрореакторах. Оптимизировать схемы и режимы работы микрочиповых аналитических систем по их параметрам, влияющим на правильность, воспроизводимость измерений, динамический диапазон сигнала, метрологические характеристики разрабатываемых методов. Разработать микрочиповые анализаторы нуклеиновых кислот с полным циклом регистрации, сбора и обработки данных для аналитической практики. Разработать методики определения нуклеиновых кислот с помощью созданных микрочиповых анализаторов и оценить их возможности для решения практических задач молекулярно-генетической диагностики.

7. Молекулярно-генетические методы анализа 7 • Пробоподготовка – выделение и очистка ДНК/РНК • Исходным материалом для получения ДНК могут служить любые микроорганизмы, содержащие нуклеиновые кислоты (лейкоциты периферической крови, ткани животных и растений, бактерии, вирусы, споры). Для одного анализа необходимо всего несколько копий ДНК/РНК (пг). • 2. Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) • ПЦР – многократное увеличение числа копий специфического участка ДНК, протекающее при циклической смене температур и катализируемое ферментом ДНК- полимеразой • 3. Детектирование продуктов ПЦР • гель-электрофорез с флуоресцентным детектированием • метод «конечной точки» с флуоресцентным детектированием • в «реальном времени» с флуоресцентным детектированием Области применения: Генетические исследования ДНК и РНК микроорганизмов, растений, животных, человека, анализ генетически-модифицированных объектов (ГМО), криминалистика, диагностика инфекционных заболеваний

8. Т, 0С праймеры ДНК- полимераза Время, с дТТФ дАТФ дГТФ ТЕРМОЦИКЛ дЦТФ дНТФ Полимеразно-цепная реакция (ПЦР) – многократное увеличение числа копий специфического участка ДНК, протекающее при циклической смене температур и катализируемое ферментом ДНК- полимеразой 8 Денатурация ДНК (90-950С) Отжиг праймеров (55-650С) Элонгация (60-720С) Продукты ПЦР (ампликоны) - копии специфического участка ДНК, синтезируемые в результате реакции ампликоны

9. Полимеразная цепная реакция 9 Градуировочная зависимость Динамическая кривая ПЦР-РВ E = (10-1/tg(α)-1)·100% Зависимость количества ДНК (N) от числа проведенных термоциклов (n)N=N0(1+E)n, где E – эффективность амплификации, N0 начальное содержание ДНК. Температурно-временной режим ПЦР

10. Выбор материала и изготовление микрочипов 10 Материалы для изготовления микрочипов Микрофлюидные чипы: КРЕМНИЙ - СТЕКЛО • Требования к материалу: • высокий коэффициент теплопроводности • прозрачность материала покровной пластины • устойчивость к повышенной температуре и растворителям • возможность легко модифицировать поверхность • технологичность изготовления и доступность производственной базы Микрореакторные чипы: КРЕМНИЙ АЛЮМИНИЙ

11. Выбор материала и изготовление микрочипов УФ 11 Методы изготовления микрочипов УФ Нанесение рисунка микроструктур на кремниевую пластину – контактная фотолитография Химическое травление микроструктур и отверстий ввода/вывода растворов в кремнии Спекание пластины кремния и покровного стекла P (160 тонн) Штамповка Al пластины Al Si Si – SiO2 9 реакторов 30 реакторов 48 реакторов

12. Выбор материала и изготовление микрочипов 12 Характеристики разработанных микрочипов

13. Общая схема микрочиповой аналитической системы 13 Предел обнаружения: Канал 1 – 1,4·10-9 M Канал 2 – 3,9·10-9M Светодиод с 4 рабочими кристаллами ПЗС матрица 1- микрочип; 2- картридж, 3- слой изолирующей жидкости, 4- система термоциклирования, 5- светодиод, 6, 8- светофильтры; 7- дихроичное зеркало; 9- цифровая ПЗС-камера; 10- система управления

14. Разработка макета ПЦР-РВ амплификатора 14 Микрочиповый ПЦР-РВ анализатор «AriaDNA» Изготовитель: «Люмэкс» Прибор: «AriaDNA» Нагрев 10 °С/с Охлаждение 10 °С/с Объем 1,0 – 3,6 мкл Кол-во реакций: от 16 до 48 Детектирование: 2 канала Si Al 48 реакторов 30 реакторов Микрочипы

15. Модификация поверхности микрочипов 15 Требования к модифицированной поверхности: • устранять влияние материалов микрочипа на эффективность ПЦР • технологичность изготовления, доступность производственной базы, воспроизводимость свойств • модификация в условиях микрофлюидных каналов • возобновляемость, многократная отмывка-нанесение • гидрофильность • защита от взаимодействия компонентов ПЦР с материалом чипа Микрофлюидные и микрореакторные чипы Микрофлюидные чипы Микрореакторные чипы

16. Модификация поверхности микрочипов 16 гидрофоб/гидрофоб гидрофил/гидрофил А) (CH3)2SiCl2 Б) SiO2

17. Модификация поверхности микрочипов 17 Гидрофильно-гидрофобная поверхность 1,5 мм Si или Al 430 мкм 150 мкм • Слой ПММС, 10 мкм • Молекулярные слои модификатора, ~100 нм • Слой оксида кремния, SiO2 , 80 – 120 нм гидрофоб/гидрофил гидрофобный слой ПММС слой ПММС вне микрореактора, слой SiO2 и слой модификатора внутри микрореактора гидрофильный слой молекулярных модификаторов слой SiO2 Si / Al основа

18. Модификация поверхности микрочипов 18 Электронейтральность поверхности Гидрофильность поверхности Предотвращение ингибирования ПЦР Кремниевый микрочип Алюминиевый микрочип 1) Создание слоя оксида кремния 2) Модификация аналогично кремние-вому микрочипу 1) Создание слоя оксида алюминия 2) Обработка поливиниловым спиртом

19. Модификация поверхности микрочипов 19 Модификация поверхности Si и Al микрочипов в плазме ВЧ-разряда Плазмохимический синтез покрытий на поверхности Si и Al 10 мин, Ar + O2/гидрофил 10 мин, Ar + OctOH/гидрофоб 20 мин, Ar + OctOH/гидрофоб 10 с, О2 / гидрофил • Оптимизация состава органических плазмо-полимеризованных слоёв: • ацетилен (г), октанол, гептан, гексаметилдисилоксан (ГМДС) (ж) • Оптимизация структуры покрытий: многослойные покрытия • Оценка защитных свойств получаемых покрытий • электроимпедансная спектроскопия EIS, EDX, видеоскопия, прочность адгезии • Повышение стабильности качества при производстве

20. Модификация поверхности микрочипов 20

21. Модификация поверхности микрочипов 21 Схемы модификации поверхности микрочипов:

22. Лиофилизация реактивов в микрочипе • Трудоемкость и длительность • стадии приготовления растворов • Хранение и транспортировка при • низких температурах • Иммобилизация всех компонентов • ПЦР-раствора • Стабилизация активности ДНК-полимеразы Количество операций 30-70% меньше Стандартный режим амплификации Ускоренный режим амплификации

23. Качественный анализ ГМО Предел обнаружения Оценка специфичности определения Количественный анализ ГМО Время выполнения ПЦР составило 23 мин Содержание ГМО в образце 0,75 ± 0,07%, Найденное содержание – 0,64 ± 0,13% Предел обнаружения ГМО составил 0,05%, что соответствует требованиям нормативных документов. 23

24. Инфекции передаваемые половым путем (ИППП) 24 Возбудители ИППП и наиболее частые клинические синдромы

25. Инфекции передаваемые половым путем (ИППП) 25 Кол-во образцов ~750 Si микрочипы (30 м/р) с лиофилизированными ТС ДС -- Диагн. специфичность = ИО / (ИО+ЛП) ДЧ -- Диагн. чувствительность = ИП / (ИП+ЛО) АЧ – Аналитич. чувствительность = 1000 копий ДНК/мл ИО -- Истинно отрицательные ЛП -- Ложно положительные ЛО -- Ложно отрицательные ИП -- Истинно положительные

26. Генетика: определение мутаций в геноме человека 26 Изучение частоты встречаемости полиморфизма генов гемостаза (F2, F5) и фолатного цикла (MTHFR) на примере донорской ДНК (n=100) Результаты ПЦР-РВ, полученные с помощью макета микрочиповой аналитической системы с использованием Si микрочипов, содержащих лиофилизированные реактивы. Кол-во проанализированных образцов донорской ДНК (n=100)

27. Сравнение методов осуществления молекулярно-генетического анализа

28. Выводы: 28 Разработаны оригинальные микрочиповые системы молекулярно-генетического анализа для определения нуклеиновых кислот методом полимеразно-цепной реакции с регистрацией флуоресцентного сигнала в реальном времени. Достигнута теоретически максимально возможная чувствительность ПЦР анализа: минимальное детектируемое содержание нуклеиновых кислот в микрореакторе составляет 1 копию ДНК. Линейный динамический диапазон определяемых содержаний 1 – 105 копий ДНК в микрореакторе, минимальная величина относительного стандартного отклонения порогового цикла 0.1. Разработаны схемы микрочипов, содержащих от 16 до 96 микрореакторов для одновременного проведения мультиплексной ПЦР-РВ и способы модификации поверхности микрореакторов из кремния и алюминия неорганическими и органическими покрытиями, обеспечивающими минимизацию сорбции компонентов ПЦР смеси. Обоснованы преимущества алюминия как материала для изготовления микрочипов при их массовом производстве. Обоснован выбор условий для серийного изготовления одноразовых микрочипов с модифицирующими покрытиями поверхности, обладающими гидрофильными и гидрофобными свойствами, что обеспечивает экспрессный ввод проб и простую герметизацию микрочипа.

29. Выводы: 29 На основании сравнительного анализа характеристик систем термоциклирования проведен выбор оптимального принципа нагрева для построения микрочипового анализатора, обладающего в совокупности быстродействием, производительностью, экономичностью и надежностью. Получены скорости нагрева и охлаждения 10-12 °С/с, при неоднородности теплового поля 0.1 °С. На основании оптимизации аналитических характеристик мультиплексной аналитической системы ПЦР-РВ достигнуты: высокое быстродействие (20 минут на 45 циклов) и производительность системы (288 ДНК-определений в час). Показано, что оптимальным диапазоном длин ампликонов для достижения максимального быстродействия при сохранении специфичности анализа является длина 80-150 п.о., что было продемонстрировано на примере исследованных ПЦР тест-систем. Оптимизирован состав лиофилизированных в микрореакторах ПЦР тест-систем под широкий круг задач молекулярно-генетического анализа. Разработана схема изготовления микрочипов с лиофилизированными реактивами, обладающих сроком хранения не менее 6 месяцев.

30. Выводы: 30 Оптимизированы условия мультиплексного определения нуклеиновых кислот в реальных объектах с использованием разработанного макета микрочипового ПЦР анализатора. Разработаны методики определения генетически-модифицированных организмов, возбудителей инфекций, передающихся половым путем, полиморфизмов в геноме человека. Достигнуты пределы обнаружения 10000 копий искомой ДНК в исходных образцах объемом 1 мл. Результаты выполненных исследований внедрены при разработке микрочипового амплификатора нуклеиновых кислот «АриаДНА», выпускаемого ООО «Люмэкс», г. Санкт-Петербург