第九章酶免疫技术

第九章酶免疫技术

第一节酶免疫技术的特点

三大经典标记技术 三大经典标记技术荧光免疫技术酶免疫技术放射免疫技术

原理及特点 抗原抗体反应的特异性 • 主要试剂: 酶标记的抗体或抗原 • 酶标物特点：免疫学活性酶对底物的催化活性 + 酶高效催化反应的专一性

原理及特点 • 特点： • 灵敏度高、特异性强、准确性好 • 酶标记试剂能够较长时间保持稳定 • 操作简便、对环境没有污染。 • 易与其它技术偶联衍生出适用范围更广的新方法。 • 原理： • 酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应 • 酶对底物的显色反应 • 对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析

酶和酶作用底物 标记酶的要求：活性高性质稳定专一性强酶催化底物的显色信号易于判断和测量方法敏感，重复性好，简单易行酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉

酶和酶作用底物 常用酶糖蛋白（主酶）亚铁血红素（辅基）主酶与酶活性无关辅基是酶的活性中心 RZ值与酶活性无关，酶活性单位比RZ值更为重要辣根过氧化物酶（HRP） RZ值：403nm （辅基）　　　与275nm（主酶）　　　OD值之比 ELISA中应用最为广泛的标记用酶

酶和酶作用底物 常用酶菌源性AP 肠粘膜AP 碱性磷酸酶（AP）用于均相酶免疫测定 β–半乳糖苷酶（β-Gal）

酶和酶作用底物 常用底物 HRP的底物 HRP DH2+H2O2→ → → D+2H2O H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种

酶和酶作用底物 常用底物四甲基联苯胺 TMB HRP的常见底物邻苯二胺 OPD 5-氨基水杨酸5-ASA 2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐 ABTS

酶和酶作用底物 HRP的常见底物 TMB反应后显蓝色，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm ，稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛的底物。 OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，致癌性。

酶和酶作用底物 常用底物经AP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405 nm。对-硝基苯磷酸酯（ pNPP ） AP的底物酶作用后，生成高强度荧光物，用荧光计测量。 4-甲基伞酮基β-D半-乳糖苷（ 4MUG ） β-Gal 的底物

酶标记抗体或抗原 酶免疫技术的核心组成部分酶结合物（conjugate）酶标记物通过化学反应或免疫学反应，让酶与抗体或抗原形成的结合物

酶标记抗体或抗原 制备方法要求 • 抗原要求纯度高，抗原性完整 • 抗体需要特异性好、效价高、亲合力强以及比活性较高，能批量生产，易纯化。

酶标记抗体或抗原 技术方法简单、产率高，重复性好制备方法要求标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性酶标记物稳定，不形成聚合物

酶标记抗体或抗原 过碘酸钠法（直接法）常用于HRP标记抗体或抗原制备方法戊二醛交联法

酶标记抗体或抗原 戊二醛交联法戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别与HRP和蛋白质分子中的氨基结合。该法有一步法和二步法。二步法标记效率比一步法高，酶标记物质量较均一。

固相载体 • 固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合到固相载体的表面 • 固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用方法

固相载体 要求 • 结合抗体或抗原的容量大 • 抗体或抗原牢固地固定在其表面 • 不影响免疫反应性 • 利于反应充分进行 • 固相方法简便易行，快速经济种类 • 塑料制品 • 微颗粒 • 膜载体

免疫吸附剂 免疫吸附剂是指与固相载体结合的抗原或抗体包被coating 将抗原或抗体结合于固相载体封闭blocking 用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～20%小牛血清消除固相载体表面未结合的位点，消除非特异性吸附

第二节　酶免疫技术分类

酶免疫组化 组织切片或其它标本中抗原的定位酶免疫技术均相酶免疫测定液体标本中抗原或抗体的定性和定量固相酶免疫测定非均相液相酶免疫测定

均相酶免疫测定 homogenous enzyme immunoassay 用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定原理酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，标记酶的活性会发生改变，不用分离结合和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性的改变，而确定抗原或抗体的含量。

均相酶免疫测定 最具代表性的两种技术酶放大免疫测定技术EMIT enzyme-mutiplied immunoassay technique 克隆酶供体免疫分析CEDIA cloned enzyme donor immunoassay

EMIT示意图

CEDIA示意图

非均相酶免疫测定 heterogeneous enzyme immunoassay 与均相不同之处 • 分类：液相酶免疫测定固相酶免疫测定以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（ELISA）是目前最为常用的固相酶免疫测定需分离游离与结合的酶标记物

第三节　酶联免疫吸附试验

ELISA enzyme-linked immunosorbent assay 原理反应加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体包被 2 1 洗涤使结合在固相上的抗原抗体复合物与未结合的分离 3 4 底物显色定性或定量的分析

ELISA方法类型及反应原理 三个必要试剂固相的抗原或抗体酶标记物（酶结合物）酶反应的底物

ELISA检测抗原的方法 • 双抗体夹心法 • 方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色 • 应用： • 二价或二价以上的较大分子抗原测定 • 乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等

洗涤洗涤洗涤洗涤 Y Y Y Y Y Y Y E E E E E E E E Y Y Y Y Y Y Y Y 1、已知抗体包被于载体表面 1、已知抗体包被于载体表面 Y Y Y Y Y Y 2、加待检物无抗原与抗体结合 2、加待检物抗原与抗体结合 Y Y Y 3、加酶标抗体无抗原结合 E 3、加酶标抗体与抗原结合 Y Y Y Y Y 4、加酶作用的底物产生颜色 4、加酶作用的底物不产生颜色 Y Y Y Y + - 双抗体夹心法测抗原

竞争法方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等）竞争法方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等） ELISA检测抗原的方法

洗涤洗涤 E E Y Y Y Y Y Y Y Y Y E E E E E 1、已知抗体包被于载体表面 1、已知抗体包被于载体表面 Y Y Y Y Y Y 2、加待检物抗原与酶标抗原竞争与抗体结合 2、加待测物和酶标抗原，酶标抗原与抗体结合 E Y Y 3、加酶作用的底物不显色或显色弱 3、加酶作用的底物显色 Y + - 竞争法测抗原

ELISA检测抗体的方法 • 间接法 • 方法用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗抗体或二抗）加底物显色。 • 优点一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体 • 应用 • 常用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定

洗涤洗涤洗涤洗涤 Y Y Y E E E E E E E E Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y 1、已知抗原吸附于载体表面 1、已知抗体吸附于载体表面 2、加待检物无抗体与抗原结合 2、加待检物有抗体与抗原结合 3、加酶标抗Ig 与抗体结合 3、加酶标的抗Ig 抗体 E Y 4、加酶作用的底物不产生颜色 4、加酶作用的底物产生颜色 Y - - + 间接法测抗体

ELISA检测抗体的方法 • 双抗原夹心法 • 原理：类似双抗体夹心法 • 操作步骤：类似 • 应用：乙型肝炎表面抗体

ELISA检测抗体的方法 竞争法 • 原理：类似检测抗原的竞争法 • 应用：乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)的检测

ELISA检测抗体的方法 捕获法应用：病原体急性感染诊断中的IgM型抗体甲型肝炎HAV-IgM抗体乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体

捕获法 原理：抗人IgMμ链抗体包被捕获待测标本中IgM类抗体加入特异性抗原和酶标记特异性抗原的抗体底物显色

1、固相化抗人 IgM Y Y Y Y Y Y 洗涤洗涤洗涤洗涤 Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y E E E E E Y Y Y Y Y 1、固相化抗人 IgM 2、加待测物特异性IgM与非特异性IgM 和抗人IgM结合 2、加待测物只有非特异性IgM 和抗人IgM结合 3、加特异性抗原，与特异性抗体结合 3、加特异性抗原，不能与非特异性IgM结合 4、加酶标抗体与特异性抗原结合，加底物显色 4、加酶标抗体无抗原结合，加底物不显色 + - 捕获法原理

第九章 酶免疫技术