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色谱分析

色谱分析. 应用化学系. 高效液相色谱. 应用化学系 孙 敏 2012.3.27. 第八章 高效液相色谱 High Performance Liquid Chromatography. 8.1 高效液相色谱法的发展 8.2 反相高效液相色谱 8.3 正相高效液相色谱 8.4 离子色谱 8.5 离子对色谱 8.6 体积排阻色谱 8.7 疏水作用色谱 8.8 胶束液相色谱 8.9 亲和作用色谱. 知识要点. 了解高效液相色谱的出现和优点； 了解高效液相色谱的分类； 掌握高效液相色谱系统的组成部分；

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Presentation Transcript

  1. 色谱分析 应用化学系

  2. 高效液相色谱 应用化学系 孙 敏 2012.3.27

  3. 第八章 高效液相色谱High Performance Liquid Chromatography 8.1 高效液相色谱法的发展 8.2 反相高效液相色谱 8.3 正相高效液相色谱 8.4 离子色谱 8.5 离子对色谱 8.6 体积排阻色谱 8.7 疏水作用色谱 8.8 胶束液相色谱 8.9亲和作用色谱

  4. 知识要点 了解高效液相色谱的出现和优点； 了解高效液相色谱的分类； 掌握高效液相色谱系统的组成部分； 掌握反相色谱的含义、分离机理、固定相和流动相组成等。

  5. 8.1 高效液相色谱法的发展The development of HPLC 8.1.1 古典液相色谱 8.1.2 高效液相色谱的出现 8.1.3 高效液相色谱的组成 8.1.4 高效液相色谱柱 8.1.5 高效液相色谱与古典 相色谱、气相色谱的比较

  6. 8.1.1 古典液相色谱 液相色谱的出现 1906年，俄国植物学家茨维特(Tsweet)用碳酸钙填充竖立的玻璃管，以石油醚洗脱植物色素的提取液，经过一段时间洗脱之后，植物色素在碳酸钙柱中实现分离，由一条色带分散为数条平行的色带。研究了叶绿素在100多种吸附剂上的吸附现象，提出了色谱法的概念。

  7. 8.1.2 高效液相色谱的出现 古典液相色谱，由于柱效低而未能发挥出潜能。 气相色谱在20世纪60年代初高速发展，但由于对高分子量的、热稳定性差的物质不适用，人们又将注意力转向了液相色谱。 20世纪70年代，液相色谱获得了高速的发展，出现了高效液相色谱。 高效液相色谱的特点： 1) 高压、高柱效、高流速、高灵敏。 2) 能够分析高沸点、热不稳定有机物。

  8. 8.1.3 高效液相色谱的组成 1. 仪器组成部分 1）高压输液泵 2）进样系统 3）色谱柱 4）检测器 2. 软件操作系统

  9. Agilent 1100—MS Agilent 1200双检测

  10. 3. 高效液相色谱分离过程中的两相 1）流动相 作为洗脱剂 2）固定相 作为分离场所

  11. 8.1.4 高效液相色谱柱 1. 高效液相色谱柱—色谱的心脏

  12. 反相色谱固定相 阴离子色谱固定相 正相色谱固定相 阳离子色谱固定相 2. 色谱固定相种类多样 载体表面修饰官能团

  13. 3. 高效液相色谱柱的装填 多采用“匀浆法”——溶剂匀浆后气动泵高压装填

  14. 8.1.5 高效液相与古典液相色谱、气相色谱的比较 1. 高效液相色谱和古典液相色谱的比较

  15. 2. 高效液相色谱和气相色谱的比较

  16. 第八章 高效液相色谱High Performance Liquid Chromatography 8.1 高效液相色谱法的发展 8.2 反相高效液相色谱 8.3 正相高效液相色谱 8.4 离子色谱 8.5 离子对色谱 8.6 体积排阻色谱 8.7 疏水作用色谱 8.8 凝胶色谱

  17. 8.2 反相高效液相色谱Revised-phase HPLC 8.2.1 高效液相色谱的分类 8.2.2 反相色谱的含义 8.2.3 反相色谱的分离机理 8.2.4 反相色谱柱和流动相 8.2.5反相色谱的应用

  18. 8.2.1 高效液相色谱的分类 按照分析物在固定相与流动相间作用机理的不同，主要分为9类： 1、反相色谱 6、亲和色谱 2、正相色谱 7、疏水作用色谱 3、离子色谱 8、胶束色谱 4、离子对色谱 9、电色谱 5、体积排阻色谱

  19. 8.2.2 反相色谱的含义 1、反相高效液相色谱 以强疏水性的填料作固定相，以与水混溶的有机溶剂或它们的混合物作为流动相的液相色谱。 2、如在硅胶上键合C18或C8烷基的非极性固定相，以极性强的水、甲醇、乙腈等作为流动相的高效液相色谱。 3、反相色谱模式在HPLC中应用最广，约占色谱应用的70%-80%，可以分离多种混合物。

  20. 8.2.3 反相色谱的分离机理 1、疏溶剂理论 完全或部分疏水性溶质分子受到极性溶剂的排斥而被非极性烃类固定相吸引，溶质分子和非极性固定相之间的作用是靠弱的色散力。 2、组分在两相之间达到分配平衡时的平衡常数又称分配系数，K=cs/cm ； cs和cm分别是组分在固定相和流动相中的浓度。

  21. 3、分配系数的意义：K值的大小表明组分与固定相分子间作用力的大小。K越大，组分与固定相的亲和力越大，保留时间越长，出峰速度越慢。3、分配系数的意义：K值的大小表明组分与固定相分子间作用力的大小。K越大，组分与固定相的亲和力越大，保留时间越长，出峰速度越慢。 4、分配系数的影响因素：温度、压力、溶质组分的性质、固定相和流动相的性质。 5、反相色谱中各组分如何实现分离?

  22. C18反相色谱柱，分6个稠环化合物 相同色谱条件下，不同组分的分配系数的差异是实现色谱分离的先决条件，相差越大，越易实现分离。极性组分先出峰，非极性组分后出峰。

  23. 8.2.4 反相色谱柱和流动相 反相色谱最关键的部分-反相色谱柱 1、目前以硅胶基质的反相色谱柱为主 1) 常规硅胶键合C18，C8等填料柱，不利于分离碱性物质。 2) 高覆盖量的反相柱，有较强的保留。 3) 高稳定性的反相柱，耐酸碱性强。 4) 高纯硅胶反相柱，基质纯度高，金属杂质少，残余硅羟基量低且酸性低，对碱性分析物的分离效果好。

  24. 2、常见的硅胶基质反相色谱填料 碳八 碳十二 碳十八 苯基

  25. 3、其它无机氧化物基质的反相色谱柱 1）硅胶基质反相柱缺陷：碱性流动相条件（pH﹥8）易溶解。 2）二氧化钛、二氧化锆或氧化铝等无机氧化物做基质的反相柱可以在碱性条件使用。 3）缺点：比硅胶的比表面积小，固定相键合量低，分离能力受到限制。 4）近年来，将耐碱性氧化物的纳米粒子自组装到多孔硅胶表面，获得耐碱性的无机氧化物/硅胶核壳型色谱基质，制备了反相柱。

  26. 杂化硅胶

  27. 表面多孔层硅胶

  28. 4、聚合物基质的反相色谱柱 1）苯乙烯-二乙烯基苯的共聚物、聚丙烯酸酯类、聚乙烯醇类以及苯乙烯与它们的共聚物等。 自身具有疏水性能够直接作为反相色谱柱填料。 在聚合物基质上化学修饰C18 ，C8等烃类分子获得反相色谱柱。 2）优点是耐酸碱，尤其适用于分离生物分子，被生物样品污染后可以用氢氧化钠清洗。 3）缺点是耐有机溶剂差，易溶胀。

  29. 5、反相色谱的流动相 1）极性溶剂或是它们的混合物 例如：水（或缓冲盐溶液）、甲醇、乙腈 2）有机溶剂纯度 色谱纯 99.99% 水纯度要求高 二次蒸馏水或多次离子交换水 3）常用混合流动相甲醇-水或乙腈-水，调节比例，使极性不同的组分获得分离，极性组分先出峰，非极性组分后出峰。 4）流动相中甲醇或乙腈增加，洗脱能力增强，各组分保留时间减小。

  30. 甲醇-水（80:20, V/V） 甲醇-水（85:15, V/V）

  31. 8.2.5 反相色谱的应用 1、反相色谱的应用十分广泛 反相色谱是高效液相色谱最重要和最为普遍的一种模式，它的应用约占高效液相色谱的70%-80%，应用非常广泛。 2、一般小分子有机物 药物，农药； 氨基酸，低聚核苷酸； 多肽，蛋白质等。

  32. 第八章 高效液相色谱High Performance Liquid Chromatography 8.1 高效液相色谱法的发展 8.2 反相高效液相色谱 8.3 正相高效液相色谱 8.4 离子色谱 8.5 离子对色谱 8.6 体积排阻色谱 8.7 疏水作用色谱 8.8 凝胶色谱

  33. 8.3 正相高效液相色谱Normal-phase HPLC 8.3.1 正相高效液相色谱的概念 8.3.2 正相色谱的固定相 8.3.3 正相色谱的流动相 8.3.4 正相色谱的分离机理 8.3.5 正相色谱的应用 8.3.6 正相色谱与反相色谱的比较

  34. 8.3.1 正相高效液相色谱的概念 1. 正相色谱 是指以亲水性的填料作为固定相，以疏水性溶剂作为流动相的液相色谱 2. 固定相 如：硅胶、硅胶上键合羟基、氨基或氰基的极性固定相 3. 流动相 如：正己烷、正己烷-异丙醇或正己烷-乙醇

  35. 8.3.2 正相高效液相色谱的固定相 极性由小到大顺序：氰基硅胶＜硅胶＜羟基硅胶＜氨基硅胶 1、硅胶 2、羟基硅胶 3、氨基硅胶 4、氰基硅胶

  36. 8.3.3 正相色谱的流动相 1、正相色谱流动相是相对于固定相极性较弱的有机溶剂或是有机溶剂的混合物。 常以正己烷或环己烷做基础溶剂，为了洗脱极性较强的溶质，加入极性溶剂，如异丙醇、乙醇、二氯甲烷、四氢呋喃等。 1) 分极性弱溶质的流动相 : 正己烷-异丙醇或正己烷-乙醇 2) 分极性强溶质的流动相: 正己烷-四氢呋喃 2、正相色谱流动相要求无水，流动相中微量的水会吸附到正相固定相上，从而减弱正相柱的极性，降低分离性能；破坏色谱柱。

  37. 8.3.4 正相色谱的分离机理 1、正相色谱的分离机理 1）溶质和固定相间的极性作用，如偶极-偶极作用、偶极-诱导偶极作用。 极性溶质与极性固定相间存在偶极-偶极作用；弱极性或非极性溶质如多环芳烃与极性固定相间存在偶极-诱导偶极作用。 2）溶质和固定相间的氢键作用、静电作用等。 2、溶质极性越强与固定相的作用越大，保留越强，需要极性较强的流动相进行洗脱，流动相中极性组分的含量增加。

  38. 8.3.5 正相色谱的应用 1、反相色谱中疏水性物质保留太强，亲水性强的物质没有保留，导致分离困难。 2、正相色谱在极性化合物的分离方面有自己的优势，而且可以选择不同极性的固定相，能够补充反相色谱难以分离分析的物质。 3、主要应用于分离类酯化合物、甾醇类、苯甲酸酯类、脂肪酸等。

  39. 8.3.6 正相色谱与反相色谱的比较

  40. 第八章 高效液相色谱High Performance Liquid Chromatography 8.1 高效液相色谱法的发展 8.2 反相高效液相色谱 8.3 正相高效液相色谱 8.4 离子色谱 8.5 离子对色谱 8.6 体积排阻色谱 8.7 疏水作用色谱 8.8 凝胶色谱

  41. 8.4 离子色谱Ion HPLC 8.2.1离子色谱的概念 8.2.2离子色谱的原理 8.2.3离子色谱的组成 8.2.4离子色谱柱 8.2.5离子色谱流动相 8.4.6离子色谱的应用

  42. 8.4.1 离子色谱的概念 离子色谱 是高效液相色谱的一种，是分析阴离子和阳离子的一种液相色谱方法。 8.4.2 离子色谱的原理 离子色谱基本原理 离子色谱的分离机理主要是离子交换 样品离子X，流动相离子Y，固定相的作用位点R 阳离子交换： 阴离子交换：

  43. 8.4.3 离子色谱的组成 1、离子色谱系统 IC系统的构成与HPLC相同，由流动相传送部分、进样装置、分离柱、检测器4个部分组成，在需要抑制背景电导的情况下通常还配有抑制器。 2、离子色谱的最重要的部件是离子色谱柱。

  44. 8.4.4 离子色谱柱 1、阳离子色谱柱 弱阳离子色谱柱离子交换基团：羧基 强阳离子色谱柱离子交换基团：磺酸基 2、阴离子色谱柱 弱阴离子色谱柱离子交换基团：氨基 强阴离子色谱柱离子交换基团：季胺 3、硅胶基质柱不耐酸碱，有机聚合物基质柱为主，如聚苯乙烯微球修饰阴、阳离子交换基团的填料柱。

  45. 8.4.5 离子色谱流动相 样品离子的置换离子的溶液，为提高灵敏度，洗脱剂中的置换离子应具有很高或很低的摩尔电导。 1）阴离子交换模式中，大分子量的有机酸和它的盐有低的电导；无机碱(OH-)有高的电导。 2）阳离子交换模式中，大分子量的季铵盐有低的电导，但强烈吸附在交换树脂上；无机酸(H+)有高的电导。

  46. 8.4.4 离子色谱的应用 离子色谱分离 1）无机、有机阴阳离子； 2）环境科学、生命科学、食品、工业等领域。

  47. 第八章 高效液相色谱High Performance Liquid Chromatography 8.1 高效液相色谱法的发展 8.2 反相高效液相色谱 8.3 正相高效液相色谱 8.4 离子色谱 8.5 离子对色谱 8.6 体积排阻色谱 8.7 疏水作用色谱 8.8 胶束液相色谱 8.9亲和色谱

  48. 知识要点 掌握离子对、体积排阻、疏水作用、胶束液相色谱和亲和色谱的含义； 掌握离子对、体积排阻、疏水作用、胶束液相色谱和亲和色谱的分离机理、固定相和流动相组成，以及应用对象。

  49. 8.5 离子对色谱 8.5.1 离子对色谱的概念 8.5.2 反相离子对色谱 8.5.3 反相离子对色谱的应用

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