牛结核病防控进展

1. 牛结核病防控进展 中国兽医药品监察所 毛开荣 13621394758 Email:maokairong@ivdc.gov.cn

2. 牛结核病

3. 病原-致病性结核分枝杆菌属 人型菌 牛型菌 • 人型菌 & 牛型菌 • 基因水平上99.95%同源 • 感染谱相互交叉 • 10%结核病人感染牛型菌 • 人型菌可感染牛 人 犬 猫 牛 马 羊 猪 鸡 (Chen, 2009)

4. 人型与牛型结核菌 结核菌在人与牛之间的传播 结核病防治的新挑战？人 -牛 除非扑灭牛结核病，否则人类结核病的控制是不会成功的。 ——世界卫生组织第七次专家委员会报告

5. 牛结核是可以控制的 • 美国1917年开始根除计划，用约50年宣布根除牛的牛结核，但野生动物依然存在感染 • 英国每年约花费7000多万英镑控制牛结核 • 澳大利亚1970至1997年历时27年根除牛结核 • 控制牛结核需要科学的方法加长期的规划 • 根除牛结核则需国家大量的投入

6. 1. 流行病学 • 传染原：开放性结核病牛是主要的传染源 • 引起牛结核病原 • 牛分枝杆菌、结核分枝杆菌。 • 引起（人）结核病原 • 结核分枝杆菌、牛型结核杆菌 • 其他动物结核病原 • 灵长类与人相似 • 其他哺乳动物与牛相似、禽类以禽型结核杆菌为主

7. 《伯杰细菌学鉴定手册》 • 分枝杆菌属为2 大类: • 缓慢生长分枝杆菌 • 快速生长分枝杆菌（通常不致病）

8. 快速生长分枝杆菌（ NTM ） • 目前发现NTM有150多种，仅20余种致病。 • 代表性菌种为 • 日内瓦分枝杆菌 • 致HIV／AIDS发生播散型NTM病，并迅速致死。I群一光产色分枝杆菌 • 代表性菌种有：堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌、猿猴分枝杆菌。 • Ⅱ群一暗产色分枝杆菌 • 代表性菌种有：瘰疬分枝杆菌、戈登分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、苏加分枝杆菌。 • Ⅲ群一不产色分枝杆菌 • 代表性菌种有鸟一胞内复合体分枝杆菌、玛尔摩分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、土地分枝杆菌、嗜血分枝杆菌。 • Ⅳ群—快速生长分枝杆菌 • 代表性菌种有：偶然分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌。

9. 缓慢生长分枝杆菌 • 结核分枝杆菌复合物(或群) • 结核分枝杆菌 • 牛分枝杆菌 • 非洲分枝杆菌 • 田鼠分枝杆菌 • 麻风分枝杆菌 • 禽结核分枝杆菌 • 副结核分枝杆菌 • ……

10. 宿主 • 牛分枝杆菌 • 主要引起牛结核病。 • 也引起人类结核病。有5%～ 10% 以上的人结核是由牛分枝杆菌引起。 • 还可感染牛、猪、人、鹿和大象等50 种温血脊椎动物。 20 多种禽类。 • 结核分枝杆菌 • 主要引起人类结核病, 参考菌株为H37Rv; • 田鼠分枝杆菌 • 引起鼠类结核病; • 非洲分枝杆菌 • 引起人类结核病。

11. 传染途径 • 主要感染途径为呼吸道和消化道。 • 相对来说，成年牛易经呼吸道感染，而青年牛易经消化道感染。 • 呼吸道感染主要由带菌尘埃或气溶胶所造成。 • 消化道感染则常因饲草、饲料被污染。 • 犊牛感染主要是吮吸带菌的乳汁造成的。 • 此外，也可通过交配感染。

12. 易感动物 • 牛 • 人、猪、鹿和大象等50 种温血脊椎动物。 • 20 多种禽类。

13. 影响因素 • 饲养管理不良，使役过度，与牛结核病的传染有密切关系。 • 特别是牛舍过于拥挤，通风不良，潮湿，光线不好，是造成本病扩散的重要因素。 • 饲料配比不当、饲料中缺乏维生素和矿物质等，均可促进本病的发生。

14. 牛结核的分布 • 广泛流行于世界各地 • 尤以奶牛业发达国家为严重。 • 地区流行或散发流行

15. 2012年全球牛结核分布

16. 诊断 • 1. 流行病学 • 2. 症状 • 3. 病理变化 • 4. 检测 • 病原 • 免疫学试验

17. 结核病检测 细菌学诊断 免疫学诊断 分子生物学 细胞免疫 体液免疫 胶体金 PPD皮试 γ-干扰素 ELISA

18. 2.症状 咳嗽 虚弱 鼻孔干酪样鼻汁 胸部干性或湿性啰音、偶尔摩擦音 体表淋巴结肿大 呼吸困难 咳嗽加重 • 临床症状只能提示但不能确定该病。 • 牛型结核分枝杆菌感染初期或轻度感染时，可能不出现临床症状。 • 通常呈慢性经过，病初症状不明显，患病较久，由于患病器官不同，症状亦不一致。 消瘦

19. 症状 16-45d 长者达数月，甚至数年、终生 潜伏期 无明显症状 不发病 肺结核 活动期 肺外结核

20. 咳嗽 • 病牛常发肺结核，易疲劳，常有短而干的咳嗽，尤其当起立、运动、吸入冷空气或尘埃时 • 随后咳嗽加重，频繁且表现痛苦。呼吸次数增多或发生气喘。 • 消瘦 • 消瘦，贫血，有的牛肩前、股前、腹股沟、颌下、咽及颈淋巴结等体表淋巴结肿大。当纵膈淋巴结受侵害肿大，压迫食道，则有慢性胀气症状。病势恶化，可能发生全身性结核，即粟粒性结核。胸膜、腹膜发生结核病灶时呈现所谓的“珍珠病”，胸部听诊可听到摩擦音。

21. 乳房感染 • 多数病牛乳房常被感染侵害，可见乳房上淋巴结肿大无热无痛，泌乳量减少，乳汁初期无变化，病重时呈水样稀薄。 • 顽固性下痢 • 肠道结核多见于犊牛，可表现为消化不良，食欲不振，顽固性下痢，迅速消瘦。

22. 性机能紊乱 • 生殖器官结核可出现性机能紊乱，发情频繁且表现性欲亢进，慕雄狂与不孕。孕畜流产，公畜副睾及睾丸肿大，阴茎前部可发生结节、糜烂等。 • 神经症状 • 中枢神经系统主要是脑及脑膜发生结核病变，常引起神经症状，如癫痫样发作、运动障碍等。

23. 禽型结核分枝杆菌感染 • 可能无临床症状，但亦可能出现昏睡和消瘦。在应激条件下，可能发生突然死亡，这往往与严重的肝脏病变有关，象这样的病变在死后解剖时容易观察到。 • 禽型结核分枝杆菌能引起人的一种渐进性的难以治疗的疾病。因此所有操作均须在有充分生物防护装置的条件下进行。

24. 人型结核分枝杆菌感染 • 除灵长类动物会出现咳嗽等症状外，其他动物一般无明显临床症状。

25. 3. 病理变化 • 牛型结核分枝杆菌感染 • 病变可发生在所有内脏器管 • 最常见的是肺、胸膜、肠系膜淋巴结。 • 感染早期，可在肺门部位及肺门淋巴结见到干酪样坏死或钙化的病灶。 • 感染中后期，可在胸膜、胸腔见到“珍珠状”增生，形成所谓的“珍珠胸”。在肠系膜可见到串珠状淋巴结肿大。

29. 分枝杆菌培养鉴定 • 实验流程 • 1、染色镜检 • 确定是否是抗酸菌的培养阳性菌株 • 2、确定该菌株属于结核分枝杆菌复合群还是NTM • 首先经对硝基苯甲酸 (PNB)生长试验、28℃生长试验、耐热触酶试验、观察记录细菌的生长速度、菌落形态和菌落颜色确定该菌株属于结核分枝杆菌复合群还是NTM。 • 3、确定该菌株属于结核分枝杆菌复合群什么型 • 进行TCH生长试验、硝酸还原试验和烟酸试验进行菌种鉴定。

30. 结核菌素反应与病变 • 牛结核菌素阳性反应，但剖检时找不到病变。 • 当牛结核病在牛群中严重流行时，遇到这种情况不多。 • 但对于牛结核病清净的牛群，这种情况就比较常见了。 • 无病变的牛结核菌素阳性反应是不是完全属于非特异性反应？ • 这种情况很难作出明确诊断，因为有些牛虽然感染牛型结核分枝杆菌，但病变很少或不明显，解剖时不易发现，有的感染牛没有任何病变。

31. 病原分离及鉴定 • 病料 • 淋巴结 • 痰 • 乳 • 精液 • 子宫分泌物 • 尿和粪便

32. 病原检测 • 染色镜检 • 培养特性 • 动物试验 • 生化试验 • 分子生物学诊断

33. 染色镜检 • 涂片 • 先在玻片上涂布一层薄甘油蛋白， • 甘油蛋白的配制：鸡蛋白20mL，甘油20mL，水杨酸钠0.4g，混匀。 • 如检验标本为乳汁等含脂肪较多的材料，在涂片制成后，用二甲苯或乙醚脱脂1－2分钟后倾去，再滴加95％酒精以除去二甲苯，待酒精挥发后即可染色。 • 然后吸取标本滴加其上，涂布均匀。

34. 萋－尼氏抗酸染色 • 涂片后，经火焰固定 • 加石炭酸复红染色液 • 用100mL 95％酒精加3g碱性复红配制成碱性复红饱和酒精溶液，取碱性复红饱和酒精溶液10mL，与5％苯酚溶液90mL混合后用滤纸滤过 • 将玻片在火焰上加热至出现蒸汽（不能产生气泡），如此热染5分钟（如染色液干涸，须加适量补充）。 • 水洗后滴加3％盐酸酒精脱色30－60秒（至无色素脱下为止） • 浓盐酸3mL，95％酒精97mL，混匀。 • 水洗后，以骆氏美兰染色液复染1分钟。 • 甲液：美兰0.3g，95％酒精30mL。乙液：0.01％氢氧化钾溶液100mL。混合即成 • 水洗，吸干，镜检。 • 抗酸菌应不被盐酸酒精脱色而染成红色，其他细菌与动物细胞可被盐酸酒精脱色而均被染成兰色。

35. 菌体形态 • 牛结核分枝杆菌呈细长平直或微弯曲的杆菌，长1.5-5微米，宽0.2-0.5微米. • 在陈旧培养基上或干酪性淋巴结内的菌体，偶而可见长达10微米或更长

36. 培养 • 将经过处理的被检样品标本接种到培养基上（同时作2－4份）培养一天后，以熔化的石蜡封口，继续培养。 • 牛型结核分枝杆菌生长缓慢，初次分离培养时，需36－37℃培养5－8周方可出现菌落。在固体培养基上不产生任何颜色，菌落湿润、略显粗糙并发脆。加1％的丙酮酸钠能促进生长。若是非典型分枝杆菌，则生长较快，大部分（但不是全部）产生白色或具有橙色或黄色色素，常形成黄色或橙色菌落。某些种类的色素只有在亮处才显出。

37. BACTEC培养法 • 利用放射性测定技术与培养技术相结合的一种技术。 • BACTEC培养法商品盒试剂。 • 本方法的优点是：比标准培养法检测到的菌量更低，培养时间更短（只需2～8周左右）。 • 本法的缺点是：费用高，需专用仪器，需防止放射性污染。

38. 用动物分离 • 豚鼠和家兔对牛型结核分枝杆菌敏感，鸡对牛型结核分枝杆菌不敏感。 • 处理过的病料，皮下或肌肉、腹腔内注射 • 接种后30天左右，进行禽型提纯结核菌素和牛型提纯结核菌素皮内变态反应试验 • 如有阳性反应，可剖检其中的半数动物进行病理学观察、细菌培养和涂片镜检。另一半继续观察至3个月再剖检观察。 • 如果为阴性反应，可于40天左右剖检其中的半数，观察病理学变化、细菌培养和涂片镜检，另一半继续观察至3个月再剖检观察。

39. 牛型、禽型和人型结核分枝杆菌鉴定 动物试验

40. 牛型、禽型和人型结核分枝杆菌鉴定 生化试验：

41. 分子生物学诊断 • DNA针 • 扩增从临床样品提取的靶序列，是来自热休克基因，大小为402碱基对(bp)片段，336bp和123bp为重复片段，或者单独插入对结核分枝杆菌特异的IS986、ISl081序列。 • PCR • 报道PCR能区别结核分枝杆菌和牛分枝杆菌。在实际应用中，需要进一步评价其特异性，特别是敏感性。 • 扩增片段可以看得见，可用生物素或地高辛代替同位素进行标记。

42. 免疫学试验 • 结核菌素皮内变态反应试验 • 全血试验 • 淋巴细胞增生试验、Υ－干扰素试验 • 血清学试验 • ELISA、胶体金

43. 结核菌素皮内变态反应试验 • 用结核菌素进行的皮内变态反应试验是检查牛结核病主要方法。亦是OIE指定国际贸易用检测试验。试验分2种，一种是牛型结核菌素单一试验，仅用牛型提纯结核菌素进行，目的是检测是否存在牛型结核分枝杆菌的感染。另一种是结核菌素比较试验，用牛型提纯结核菌素和禽型提纯结核菌素同时进行，这是一种鉴别诊断试验，用以明确是牛型结核分枝杆菌感染，还是禽型或副结核分枝杆菌或其他分枝杆菌感染。

44. 剃毛 颈侧中部上三分之一 测量皮皱厚,记录,标记 PPD稀释成2万单位/ml,注射2000单位/0.1ml 皮内注射结核菌素 • 75%酒精消毒术部; • 左手捏起皮肤，右手持针管; • 将针头与皮肤成30-45°角刺入表皮与真皮之间，缓慢注入药液; • 以局部形成丘疹状隆起为准。 72小时 测量皮皱厚,记录,标记 PPD皮试操作流程

45. 皮试工具

46. 判定标准

47. 结核菌素皮内变态反应的特点 • 世界动物卫生组织OIE迄今为止唯一推荐的牛结核病的诊断方法 • 非特异性反应 • 重症牛敏感性低 • 操作复杂烦琐 • 结果判断主观性大

48. 皮内变态反应比较试验 • 本试验采用牛型提纯结核菌素和禽型提纯结核菌素同时进行。 • 操作方法： • 在牛颈中部选2个点，一个在上1/3处一个在下1/3处。2个点之间的距离不得少于10cm。注射点及周围的皮肤应无异常。 • 禽型提纯结核菌素的注射剂量为每头0.1ml，含0.25万IU。即将禽型提纯结核菌素稀释成每毫升含2.5万IU后，皮内注射0.1毫升。 • 牛型提纯结核菌素的注射剂量为每头0.1ml，含0.20～0.5万IU。即将牛型提纯结核菌素稀释成每毫升含2.0～5.0万IU后，皮内注射0.1毫升。

49. 结果判定 • a)牛型提纯结核菌素皮内变态反应试验阳性。 • 对牛型提纯结核菌素的反应为阳性（局部有明显的炎性反应，皮厚差大于或等于4.0 mm），并且对牛型提纯结核菌素的反应大于对禽型提纯结核菌素的反应，二者皮差在2.0 mm以上，判为阳性。 • 对已经定性为牛型结核分枝杆菌感染的牛群。其中即使少数牛的皮差在2.0 mm以下，甚至对牛型提纯结核菌素的反应略小于对禽型提纯结核菌素的反应（反应差小于或等于2.0 mm），只要对牛型提纯结核菌素的反应在2.0 mm以上，也应判定为牛型提纯结核菌素皮内变态反应试验阳性牛。

50. b)禽型提纯结核菌素皮内变态反应试验阳性。 • 对禽型提纯结核菌素的反应大于对牛型提纯结核菌素的反应，两者的皮差在2.0 mm以上，判为禽型提纯结核菌素皮内变态反应试验阳性。 • 对已经定性为副结核分枝杆菌或禽型结核分枝杆菌感染的牛群。其中即使少数牛的皮差在2.0 mm以下，甚至对禽型提纯结核菌素的反应略小于对牛型提纯结核菌素的反应（不超过2.0 mm），只要对禽型提纯结核菌素的反应在2.0 mm以上，也应判为禽型提纯结核菌素皮内变态反应试验阳性牛。