دانشگاه آزاد اسلامي واحد كرج

1. دانشگاه آزاد اسلامي واحد كرج

3. پایان نامه های دكتري حرفه اي

4. گروه : علوم پزشكي

5. رشته تحصيلي : دامپزشكي

6. بررسي اثر نيسين بر روي توليد آنتروتوکسين هاي مختلف تيپ A و B استافيلوکوک طلايي با استفاده از روش الايزا

7. نام و نام خانوادگي دانشجو : پوريا طيران ، شماره دانشجويي : 79151282656

8. به راهنمايي :افشين آخوندزاده • چكيده: • طرح آزمايش: بررسي نيسين بر روي رشد (رسيدن به cfu/ml 6 10 يعني حد تو کسين زايي) و توکسين زايي اسافيلوکوک طلايي در محيط آبگوشت قلب و مغز متأثر از غلظتهاي مختلف (صفر، 25/0 ، 5/0 ،75/0 و 1درصد) نيسين (که اين سري غلظت هاي مورد مطالعه توسط بررسي هاي ارگانولپتيکي و مطالعات در مدل هاي آزمايشگاهي بدست آمده) در دو درجه حرارت 25 و 35 درجه سانتيگراد مي باشد. نيسين مورد استفاده و آماده سازي آن براي تحقيق: نيسين مورد مورد مطالعه مربوط به شرکت سيگما تهيه سپس دراسيد سيتريک يا اسيد استيک ويا يک اسيد معدني مثل اسيد کلريدريک دو درصد حل سپس فيلتر استريلاسيون ( 0.45 m ) انجام شد. باکتري هاي مورد مطالعه: از باكتري ليوفليزه استاف طلايي 6539 ATCC قادر به توليد توکسن هاي A-D)ِ) اهدايي انستيتو تحقيقاتي بهداشت مواد غذايي اتريش. در ابتدا از اين كشت ليوفليزه در محيط آبگوشت قلب و مغز در 35 درجه سانتيگراد بمدت 18-16 ساعت (over night) حداقل دو مرتبه بصورت متوالي كشت داده شد، سپس بررسي تعداد باکتري در هر ميلي ليتر کشت دوم و تکرار کشت و شمارش مجدد حداقل براي 3 بار متوالي و در نهايت مشخص شدن تعداد باکتري در هر ميلي ليتر و نگهداري اين كشت (over night) بصورت 1 به 5 با گليسرين 50% استريل مخلوط و در حجمهاي 100 ميلي ليتر در ميكروتيوبهاي اپندروف در 30-درجه نگهداري شده و هر بار براي آزمايش از اين كشت نگهداري شده در 20- سانتيگراد استفاده مي شود. و از اين كشت دوم براي تحقيق مورد استفاده قرار گرفته مي شود. تهيه ميزان تلقيح باكتريايي: تهيه ميزان تلقيح باكتريايي با اتتقال كشت نگهداري شده در 20- سانتيگراد در برات(BHI) و نگهداري در 35 درجه بمدت 18-16 اسعت و مجدداً كشت از آبگوشت 18 ساعته اول بر روي برات ديگر به مدت 18 ساعت، 35 درجه صورت مي پذيرد سپس لوله هاي استريل Cuvett تهيه گرديده و به آنها 5 ميلي ليتر از محيط برات(BHI) استريل اضافه مي گردد. سپس ابتدا براي بار اول مقدار مختلفي از آبگوشت 18 ساعته دوم در روي لوله هاي Cuvettمختلف حاوي 5 ميلي ليتر برات(BHI) برده با استفاده از دستگاه اسپكتروفتومتر در طول موج 600 نانومتر طول موجشان خوانده مي شود. پس از اين لوله هاي Cuvettجهت شمارش تعداد باكتري ها استفاده مي شود تا در نهايت لوله اي Cuvett كه داراي 107×2 باكتري در ميلي ليتر مي باشد مشخص گردد. بدين ترتيب در دفعات بعدي انجام آزمايش در هر بار مشخص شدن جذب نوري مورد نظر بطور تقريبي مقدار 107×2 باكتري در هر ميلي ليتر ، مشخص مي گردد (كه بعدا با كشت بر روي آثار شمارش نيز تاييد مي شود). سپس همانگونه كه بعداً بيان ميشود از اين لوله Cuvett حاوي 107×2 باكتري جهت تهيه دوز تلقيح مورد استفاده در تحقيق يعني3 10 باكتري در هر ميلي ليتر استفاده ميشود. تـهيه مدل سوبستراي آبگوشت قلب و سوپ تجارتي واضافه نمودن نيسين در غلظت هاي مورد نظر و تلقيح باکتريايي در ميزان دوز تلقيح cfu/ml 3 10 و گرمخانه گذاري در درجات حرارتي مورد نظر و بررسي رشدي (شمارش جهت بررسي رسيدن به cfu/ml 6 10 و تأييد آن با استفاده از روشهاي بيوشيميايي و سرولوژيک) در25 و 35 درجه سانتيگراد به مدت 21 روز مي باشد و پس از آن برسي توليد توکسين با استفاده از کيت هاي تجارتي الايزا انجام شد.