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血清 LDH 及其同工酶测定

血清 LDH 及其同工酶测定. 刘湘帆. LDH 作用： 乳酸脱氢酶（ lactate dehydrogenase, LD 或 LDH ）在辅酶 I （ NAD + ）为氢受体时，催化 L- 乳酸为丙酮酸。 L- 乳酸 丙酮酸 NAD+ NADH+H +. LDH. 分布： 特异性差 心肌、 骨骼肌、肾脏 、 肝、脾、胰、肺、肿瘤、 红细胞 肾 ＞ 心肌 ＞ 骨骼肌 ＞ 肝 ＞ 脾 ＞ 胰 ＞ 肺. 1 方法. (1) 分光光度法

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血清 LDH 及其同工酶测定

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Presentation Transcript

  1. 血清LDH及其同工酶测定 刘湘帆

  2. LDH作用： 乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LD或LDH）在辅酶I（NAD+）为氢受体时，催化L-乳酸为丙酮酸。 • L-乳酸 丙酮酸NAD+ NADH+H+ LDH

  3. 分布：特异性差心肌、骨骼肌、肾脏 、肝、脾、胰、肺、肿瘤、红细胞肾 ＞ 心肌 ＞ 骨骼肌 ＞ 肝 ＞ 脾 ＞ 胰 ＞ 肺

  4. 1 方法 (1) 分光光度法 1）利用顺向反应（pH 8.8-9.8）：340nm处连续观察NADH的产生速度。 2）利用逆向反应（pH 7.4-7.8）：340nm处连续观察NADH的消失速度。 分光光度法能利用顺、逆双相反应，线性范围较广。但要求保持测定体系于最适温度下，否则会影响测定的准确性。

  5. (2)比色法测定LD总活性 1） 原理： 乳酸脱氢酶（LD） 乳酸 丙酮酸 丙酮酸 2,4-二硝基苯肼 丙酮酸-二硝基苯腙 碱性溶液中呈棕红色颜色的深浅与丙酮酸的浓度呈正比。

  6. 2） 试剂： • 基质缓冲液（pH 8.8） • NAD+溶液（11.3mmol/L） • 丙酮酸标准液（0.5mmol/L） • 2,4-二硝基苯肼溶液（1mmol/L） • 氢氧化钠溶液（0.4mmol/L）

  7. 单位定义： • 以100ml血清，37℃与基质作用15min，生成1umol丙酮酸为一个金氏单位。 • 参考值： 血清LD：190-437金氏单位。

  8. 3)操作步骤 1 LD活性测定 加入物 对照管 测定管 血清 - 0.05 基质缓冲液 0.5 0.5 混匀，放37°C水浴5min NAD+溶液 - 0.1 混匀，放37°C水浴15min 2，4-二硝基苯肼溶液 0.5 0.5 NAD+溶液 0.1 - 混匀，放37°C水浴15min 0.4mol/LNaOH 5.0 5.0 ※室温放置5min进行比色，波长440nm

  9. 2 LD校正曲线制作 加入物（ml） B 1 2 3 4 丙酮酸标准液 0 0.05 0.1 0.15 0.20 基质缓冲液 0.5 0.45 0.40 0.35 0.30 蒸馏水 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15 2,4二硝基苯肼 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 混匀，放37°C水浴15min 0.4mol/LNaOH 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 LD活性单位 0 250 500 750 1000

  10. 临床意义 • ①心肌损害： 心肌梗塞、充血性心衰、心肌炎 • ②肝脏疾病:病毒性肝炎、肝硬化、原发性肝癌 • ③其它:骨骼肌的损伤、恶性肿瘤（白血病、淋巴瘤等）、肺梗塞等

  11. 注意事项： • ①标本不能溶血，也不能用草酸盐抗凝血。 • ②由于LD4，LD5对冷不稳定，不宜冰箱存放，血清标本在室温下可稳定2-3天。

  12. LD同工酶的测定

  13. LD同工酶H亚单位 心肌 M亚单位 肌肉LD1（H4） 心肌LD2 （H3M） 心肌LD3（H2M2） 肺、脾LD4（HM3） 肝、骨骼肌LD5 （M4） 肝、骨骼肌正常成人：LD2>LD1>LD3>LD4>LD5

  14. 人体某些组织中LDH同工酶电泳图谱 LDH1 LDH2 LDH3 LDH4 LDH5 心肌 ++++ +++ ++ + +红细胞 +++ ++++ ++ + +肾上腺 ++ +++ ++++ ++ +骨骼肌 + + ++ ++++ +++肝 + + + + ++++ 总之：复基因位点同工酶在生物体内可以各个同工酶独自存在，也可以以杂化体形式存在。

  15. LD1 LD2 LD3 LD4 LD5 H M

  16. 二、测定方法： • 柱层析法 • 免疫化学法 • 热稳定性和抑制法 • *电泳法： 醋酸纤维素薄膜 聚丙烯酰胺凝胶 琼脂糖

  17. 原理： • 根据LD同工酶一级结构和等电点的差异，在一定电泳条件下，使LD在支持物上被分离。 • 乳酸脱氢酶（LD） • 乳酸 丙酮酸

  18. NADH + 氧化型PMS 还原型PMS + NAD+ • 还原型PMS + 四氮唑盐类 氧化型PMS + 甲臢 • 当有LD活性的区带存在即显紫红色，颜色深浅与酶活性成正比，借助于扫描仪或光密度仪，可进一步求出相对含量。

  19. （-） （+） 例如，LDH同工酶 LDH2、LDH3、LDH4、LDH5都比LDH1有较多的碱性氨基酸，在pH8.6的巴比妥缓冲液中LDH1带有更多的负电荷，因而向阳性泳动最快。

  20. 试剂： • 巴比妥缓冲液（pH 8.6） • 巴比妥盐酸缓冲液（0.082mol/L， pH 8.2） • EDTA-Na2溶液（10mmol/L） • 缓冲琼脂糖凝胶（8g/L和 5g/L） • 底物显色液和固定漂洗液

  21. （3）操作 • ①凝胶板制备 • ②加样 • ③电泳 • ④显色 • ⑤固定和漂洗

  22. （4）计算： • A总（吸光度总和）= A1 + A2 + A3 + A4 + A5 • （A1~A5 相应为LD同工酶LD1~LD5的吸光度。） • LD同工酶的百分比（%）为： • LD1 = A 1/ A总× 100% • LD2 = A 2/ A总× 100% • LD3 = A 3/ A总× 100% • LD4 = A 4/ A总× 100% • LD5 = A5 / A总× 100%

  23. 临床意义 • ①心脏疾病 • 心肌梗塞 LD1＞ LD2 • 充血性心衰，心肌炎 LD1＞ LD2 • ②肝脏疾病 • 病毒性肝炎 LD5 ＞LD4 • 肝硬化，原发性肝癌 LD5↑↑，LD5 ＞LD4 • ③恶性肿瘤 • 白血病、结肠癌等 LD3↑，LD3＞LD1 • ④肌肉疾病 • 肌肉损伤、肌萎缩 LD5↑

  24. 注意事项 • ①不宜用溶血标本。 • ②严格控制温度（LD4和LD5，特别是LD5对热敏感，如底物显色液温度超过50℃，LD5易失活）。 • ③底物显色液需避光保存，因PMS对光敏感，否则显色后的凝胶板背景颜色深而影响结果。 • ④LD同工酶对冷的敏感性不同，尤其是LD5对冷不稳定。因此血清标本应该放室温保存

  25. CK及其同工酶的检测

  26. 分布 • 骨骼肌 • 心肌 • 脑组织 • 平滑肌（胃肠道、子宫） • 在肝及红细胞中测不到CK的活性。

  27. 原理 Creatine Kinase（CK, EC 2.7.3.2， ATP:肌酸磷酸转移酶）pH9.0ATP + 肌酸　 ←──→ 磷酸肌酸 + ADPpH7.0CK: MM, MB, BB, Mt MW 86 000

  28. ADP + 磷酸烯醇式丙酮酸 丙酮酸激酶 丙酮酸 + ATP 丙酮酸-2，4-二硝基苯腙

  29. 实验操作 加入物 B S U 血清 - - 0.1 标准 - 0.1 - （1mmol/L;200U/L） H2O 0.1 - - 酶试剂 0.5 0.5 0.5 37℃ 15min DNP O.5 0.5 0.5 37℃ 15min NaOH 4 4 4 室温 5min 440nm比色 肌酸、ATP、丙酮酸激酶、磷酸烯醇式丙酮酸

  30. 临床意义 （1）引起血清CK活性升高的疾病 1）心脏疾病： 急性心肌梗塞 （病毒性）心肌炎 心外膜炎

  31. 2）肌性疾病： 进行性肌营养不良、多发性肌炎、皮肌炎 肌萎缩 3）中枢神经系统疾病 脑血管意外、脑膜炎、颅脑外伤 4）肺疾病 肺栓塞等

  32. （2）引起血清CK活性降低的疾病（较少） 甲状腺功能亢进 全身性红斑狼疮 严重感染、败血症等

  33. 7、注意事项 （1）本实验的许多试剂都易失效，故最好在每次实验前临时配制。 （2）肌酸呈色不稳定，振荡充分与否直接影响呈色的深浅及过程，用旋涡混合器充分振荡15s，37℃水浴5min后，颜色可达最高点，并持续30min以上。

  34. CK同工酶

  35. CK同工酶测定原理 磷酸肌酸 ＋ ADP CK 肌酸 ＋ ATPATP ＋ 葡萄糖 己糖激酶 葡萄糖-6-磷酸 ＋ ADP葡萄糖-6-磷酸 ＋ NADP+ 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶6-磷酸葡萄糖酸 ＋ NADPH ＋ H+

  36. CK-MB测定 1. 电泳法测定CK-MB 琼脂糖介质，醋酸纤维素薄膜酶定位: CK-BB ─ 白蛋白区 CK-MB ─α2 ～β区CK-MM ─ γ区 CK-Mt ─γ后参考值：CK-BB 0% CK-MB 0 ～3% CK-MM 97 ～100% CK-Mt 0% CK-MB 阳性决定水平为5%

  37. 试剂 • （1）50mmol/L Tis-巴比妥缓冲液（pH 8.0） • （2）30mmol/L Tis-巴比妥缓冲液（pH 8.6） • （3）5g/L 琼脂糖 • （4）400mmol/L Bis-Tis缓冲液（pH 7.0） • （5）辅酶溶液 • （6）底物显色液 • （7）混合底物显色液

  38. 操作 • （1）制备凝胶玻片 • （2）加样 • （3）电泳 • （4）显色 • （5）固定和漂洗 • （6）观察结果

  39. 参考值 • （1）CK-BB： 0% • （2）CK-MB： 0% ~ 3% • （3）CK-MM： 97% ~100% • （4）CK-Mt： 0%

  40. 引起CK-BB升高的疾病 • 急性颅脑外伤 • 脑血管疾病 • 急性细菌性脑膜炎 • 引起CK-BM升高的疾病 • 急性心肌梗塞 • 心肌炎 • 进行性肌营养不良

  41. 注意事项 • （1）电泳需较高的pH值，酶反应需较低pH。 • （2）CK不稳定，对光、热及高pH敏感，最好将及时分出的血清充CO2后塞紧管口，置冰室或-30℃保存，至少可稳定半个月，及时测定效果更好。 • （3）血清CK活性随温度升高而升高，直至45℃，更高温度时CK活性迅速下降，56℃很快失活，琼脂糖电泳法测CK同工酶时，决不能像作LD同工酶用温度较高的琼脂糖底物显色液，否则CK活性丧失，而非脱氢酶（NDH）反应显著。

  42. CK-MM亚型 CK-MM亚型: MM3─基因型、组织型 M2M2MM2─ -Lys M1M2 MM1─ -2 Lys M1M1CK-MB亚型: CK-MB1－ -2Lys, CK-MB2（组织型）

  43. CK-MM亚型电泳法测定原理 在电泳缓冲液中加入Polybuffer, 通电后形成一pH梯度，进行等电聚胶电泳，自阳极至阴极依次为CK-MM1、CK-MM2和CK-MM3。然后以常规CK同工酶电泳法原理进一步定量。参考值CK-MM1 57.0±4.7% CK-MM2 26.5±5.3% CK-MM3 15.8±2.5% CK-MM3/CK-MM1 0.28±0.05（0.15--0.39）

  44. 心肌酶谱测定的临床意义 1．诊断心肌坏死和损伤 （1）早期诊断心肌梗死心肌酶 初次升高的 峰值时间 回复正常 通常采样 时间范围(h) (非溶栓) 时间 时间表 CK 4 24 3～5d CK-MB 3～12 24h 48～72h 每12h*一次×3 CK-MM3 1～6 12h 38h 胸痛后60min～90min CK-MB2 2～6 18h 未知 同上 LDH 12～18 3d 7～14d LDH1 8～10 24～48h 10～14d 胸痛后24h一次 AST 6～8 48～60 4～5d ASTm 12 36h 5d 胸痛后12h一次×3

  45. 心肌梗死诊断的实验室指标的特性 －－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－ 实验室 分子量 生理半衰期 升高时间 峰值时间 恢复正常时间 指标 (KD) (h) (h) (h) (d) －－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－ CK 86 17 3~12 12~24 3~4 CK-MB活性 86 13 3~12 12~24 2~3 CK-MB质量 86 13 2~6 12~24 3

  46. 早期急性心肌梗死的诊断灵敏度 －－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－ 胸痛后时间(h) 指 标 ----------------------------- 0～2 3～4 5～6 -----------------------------------------CK 15 35 70 CK-MB活性 10 25 55 CK-MB质量 30 70 90 -----------------------------------------

  47. 1．诊断心肌坏死和损伤（1）早期诊断心肌梗塞（2）有助于非Q波急性心肌梗死的诊断 （3）诊断梗塞延展或再梗死 （4）估计心肌梗死面积 （5）围手术期和围产期心肌损伤的诊断 （6）监护心肌损害或药物对心肌的损害

  48. 2．判断心肌再灌注 心肌酶 建议标准 敏感性（%） 特异性（%）CK 达峰值时间<4h 10 82 达峰值时间<16h 39 81 CK-MM亚型 CK-MM3下降率>3.1%/h 87 74～90 60min内CK-MM3/CK-MM1>0.35 60 100 CK-MM3升高率>0.18%/min 92 100 CK-MB 1h升高率>0.04UL-1min-1 92 20下壁心梗90min后增加2.2倍 77 100 前壁心梗90min后增加2.5倍 92 100 CK-MB亚型 2h CK-MB2/CK-MB1峰值>3.8 82 78

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