第八章 微生物的遗传变异和育种

1. 　第八章 微生物的遗传变异和育种 第一节 遗传变异的概念及物质基础 第二节 基因突变与基因重组 第三节 微生物育种 第四节 基因工程 第五节菌种保藏

2. 第八章 微生物的遗传变异和育种 • 生物体最本质的属性之一。 • 遗传，讲的是亲子间的关系，指生物的上一代将自己的一整套遗传因子传递给下一代的行为或功能，它具有极其稳定的特性。 • 变异：指生物体遗传物质结构或数量的改变，即遗传型的改变。

3. 微生物与遗传学研究： • 个体结构简单；营养体多为单倍体；易于在成分简单的合成培养基上生长繁殖；繁殖速度快；易于累积不同的最终代谢产物及中间代谢物；菌落形态特征的可见性与多样性；环境条件对各个体作用具有直接性和均一性；易于形成营养缺陷型；一般都有相应的病毒；存在多种处于进化过程中的原始有性生殖方式等。 • 研究现代遗传学和重要的生物学基本理论问题，微生物是最佳材料和研究对象。

4. 第一节 遗传变异的概念及物质基础 • 一、基本概念 • （一）、遗传型、基因型：某一生物个体所含有的全部遗传因子（基因的总和）。 • 具有某遗传型的生物只有在适当的环境条件下，通过自身的代谢和发育，才能将它具体化，即产生表型。 • ----------　　代谢----遗传型+环境条件------->表型--------------　发育----

5. 一、基本概念 • （二）、表型：某一生物体所具有的一切外表特征及内在特性的总和，是遗传型在合适环境下的具体体现。 • 表型是一种现实性。

6. 一、基本概念 • （三）、变异：在某种外因或内因的作用下，生物体遗传物质结构或数量的改变，即遗传型的改变。 • 变异特点：在群体中以极低的几率(一般为10-5～10-10)出现；性状变化的幅度大；变化后的新性状是稳定和可遗传的。

7. 一、基本概念 • （四）、饰变：不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、翻译水平上的表型变化。 • 饰变特点：整个群体中每一个体都发生同样变化；性状变化的幅度小；饰变性状不遗传。 • 例如，粘质沙雷氏菌25℃培养，产生深红色灵杆菌素，把菌落染成鲜血似的(因此过去称它为“神灵色杆菌”或“灵杆菌”)；37℃时，群体中所有个体都不产色素。重新降温至25℃ ，所有细胞产色素能力又可以恢复。

8. 二、证明核酸是遗传变异　　物质的经典实验 • （一）、转化实验 • （二）、噬菌体感染实验 • （三）、植物病毒的重建实验

9. （一）转化实验 • 英， F.Griffith ，1928年研究肺炎链（双）球菌发现转变现象。 • 肺炎链（双）球菌，球菌，成双或成链，致人肺炎、小鼠败血症。有许多不同菌株，有荚膜者具致病性，菌落表面光滑，称S型；有的不形成荚膜，无致病性，菌落外观粗糙，称R型。

10. F.Griffith的三组试验： • 1、动物试验：小白鼠体内加入活R菌或死S菌，小白鼠活；小白鼠体内加入活S菌，小白鼠死；小白鼠体内加入活R菌和热死S菌，小白鼠死，抽心血分离，发现有活的S型细胞－转化现象。 • 2、细菌培养试验：热死S菌在培养皿中培养，不生长；活R菌在培养皿中培养，长出R菌；热死S菌和活R菌在培养皿中培养，长出大量R菌和10-6S菌。 • 3、S型菌无细胞抽提液试验：活R菌加S菌的无细胞抽提液，在培养皿中培养，长出大量的R菌和少量的S菌。

11. (a)无毒菌系RII不使白鼠死亡，从鼠体内分离仍得无毒细菌；(b)将SIII加热杀死，不使白鼠死亡，鼠体内无有毒细菌；(c)混合活RII和加热杀死的SIII，使白鼠死亡，并在死鼠体内发现活的SIII细胞(a)无毒菌系RII不使白鼠死亡，从鼠体内分离仍得无毒细菌；(b)将SIII加热杀死，不使白鼠死亡，鼠体内无有毒细菌；(c)混合活RII和加热杀死的SIII，使白鼠死亡，并在死鼠体内发现活的SIII细胞

12. （一）转化实验 • 以上实验说明，加热杀死的S型细菌，在其细胞内可能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入R型细胞，并使R型细胞获得稳定的遗传性状。

13. （一）转化实验 • 1944年，美Avery等进行了离体条件转化实验。 • 1、从活S菌分离提纯各种细胞成分——DNA，RNA，蛋白质，荚膜多糖等。 • 2、将各组分逐个与活R菌混合（①加S菌的DNA； ②加S菌的DNA及DNA酶以外的酶；③加S菌的DNA和DNA酶(分解DNA)；④加S菌的RNA；⑤加S菌的蛋白质；⑥加S菌的荚膜多糖），体外培养。 • 3、结果：①、②长出S菌；③、④、⑤、⑥只长R菌。

14. 自SIII抽提的DNA与活R菌系细菌混合，少数R细胞转化成S细胞。加脱氧核糖核酸酶(DNase)可阻止转化作用

15. （一）转化实验 • 上述结果说明： • S菌DNA将R型转化为S型。 • DNA纯度越高，转化效率越高。微量纯DNA(6×10-8g)，仍有转化能力。 • S菌转移给R菌的，不是某一遗传性状(如荚膜多糖)本身，而是以DNA为物质基础的遗传信息。

16. （二）噬菌体感染实验 • 1952，A.Hershey等利用示踪元素，证明DNA是噬菌体遗传物质。 • 以放射性32PO3-4或35SO2-4作为磷源或硫源培养E.coli，让T2噬菌体（只有核酸和蛋白质）感染E.coli，获得含32P-DNA核心的噬菌体或含35S-蛋白质外壳的噬菌体。 • 将32P-DNA噬菌体、35S-蛋白质外壳噬菌体分别感染无放射性的E.coli ，搅拌离心，观察。发现DNA是噬菌体遗传物质。 • 

17. 用含32PDNA(核心)的噬菌体作感染实验

18. 用含35S蛋白质(外壳)的噬菌体作感染实验

19. （三）植物病毒的重建实验： • 1956，美H.Fraenkel-Conrat，TMV（RNA）和HRV（与TMV近缘的霍氏车前花叶病毒）。 • 将TMV放在一定浓度的苯酚溶液中振荡,使蛋白质外壳与RNA分离。 • 分离的RNA能感染烟草患典型症状,病斑中能分离出正常病毒粒子。 • RNA裸露，缺乏蛋白质衣壳保护，感染频率低于正常TMV粒子的感染频率。

20. TMV重建实验示意图(粗线 箭头表示遗传信息的去向)

21. 二、证明核酸是遗传变异　　物质的经典实验 • 通过上述三个经典实验，确信无疑地得出结论，只有核酸才是贮存遗传信息的真正物质。

22. 三、遗传物质在细胞中的存在方式 • （一）、细胞水平：核或核质体 • （二）、细胞核水平：核内染色体(核基因组)，核外染色体（真核质粒、质体－线粒体、叶绿体；原核质粒：F因子性因子、R因子抗性因子、Col质粒产大肠杆菌素因子、Ti质粒诱癌、巨大质粒固氮、降解性质粒降解复杂物质） • （三）、染色体水平 ：数目，倍数 • （四）、核酸水平：DNA，RNA

23. 三、遗传物质在细胞中的存在方式 • （五）、基因水平 ：具有特定核苷酸顺序的核酸片段，具有自主复制能力的最小遗传功能单位。相对分子量约为6.7×105Da，1000--1500bp( 碱基对)，每个细菌一般含有5，000—10，000个基因。

24. 三、遗传物质在细胞中的存在方式 • （六）、密码子水平：决定3个核苷酸顺序（AA）的片断，遗传的信息单位。 43=64＞20－23，出现一种以上密码子编码同一种氨基酸的现象。有些被用作“起读”(AUG)或“终止”信号(UAA、UGA和UAG)。 • （七）、核苷酸、碱基水平：最低突变单位或交换单位（A、G、T、C）。

25. 三、遗传物质在细胞中的存在方式 • 原核生物的基因调控系统是由操纵子（启动基因、操纵基因、结构基因）和调节基因组成。 • 结构基因决定多肽(酶及结构蛋白)的合成，操纵基因与结构基因紧密连锁在一起的，控制结构基因转录的开放或关闭。启动基因是转录起始部位。 • 调节基因一般与操纵子有一定间隔距离(一般小于100个碱基)，调节结构基因的活动。

26. 三、遗传物质在细胞中的存在方式 • 顺序：启动基因－操纵基因－结构基－调节基因 • 关闭转录：调节基因转录出自己的mRNA,经翻译产生阻遏蛋白,识别并附着在操纵基因上，相互作用使DNA双链无法分开，阻挡RNA聚合酶沿着结构基因移动。 • 启动转录：阻遏蛋白从操纵基因上解除；依赖于DNA的RNA多聚酶附着在启动基因上，通过操纵基因，沿着结构基因移动，转录mRNA。

27. 三、遗传物质在细胞中的存在方式 • 真核生物的基因：没有操纵子结构，存在不编码序列和重复序列，转录与翻译有空间分隔，基因之间被许多无编码功能的内含子阻隔。

28. 四、原核生物的质粒 • cccDNA：游离于染色体外，具有独立复制能力的小型共价闭合环状DNA分子。1984，天蓝色链霉菌等，发现线形质粒。 • 某些质粒具有与核染色体整合和脱离的功能，如F因子，称“附加体”。 • 分子量一般在106～108Da，大小约为1%核基因组。携带染色体上没有的基因，赋予某些特殊功能，例如接合、产毒、抗药、固氮、产特殊酶或降解有毒物质等。 • 质粒消失不会造成菌体死亡 。

29. 四、原核生物的质粒 • 质粒复制与核染色体同步，称“严紧型复制控制”，细胞一般含1～2个质粒；不同步，称“松弛型复制控制”，一般含10～15个或更多。 • 质粒之间及质粒与核染色体之间可以发生重组。 • 少数质粒可以在不同菌株间发生转移，如F、R等。 • 遇吖啶类染料、丝裂霉素C、紫外线、利福平、重金属离子或高温等因素，可使子代细胞中质粒消失。

30. 四、原核生物的质粒 • （一）、F因子、致育因子或性因子：E.coli等细菌中决定性别。约等于2%核染色体DNA的小型cccDNA。分子量为6.2×107Da，94.5kb（千碱基对），其中有1/3的基因与接合作用有关。

31. 四、原核生物的质粒 • （二）、R因子、R质粒： • 多数由相连的两个DNA片段组成。其一称RTF质粒(抗性转移因子)，含有调节DNA复制和拷贝数的基因及转移基因，有时还有四环素抗性基因。11×106Da。其二为r质粒（抗性决定质粒），几百万至100×106Da以上。含其他抗生素的抗性基因，例如抗青霉素、安比西林、氯霉素、链霉素、卡那霉素和磺胺等基因。

32. 一种可通过接合而转移的R因子的形成(IS因子是转座因子，可使RTF质粒和r决定质粒结合)

33. 四、原核生物的质粒 • （三）、Col因子、产大肠杆菌素因子。大肠杆菌素是E.coli某些菌株分泌的细菌毒素，具有通过抑制复制、转录、翻译或能量代谢等，专一地杀死其他肠道细菌的功能。约4～8×104Da。 • 携带Col因子的菌株，由于质粒本身编码一种免疫蛋白，从而对大肠杆菌素有免疫作用，不受其伤害。

34. 四、原核生物的质粒 • （四）、Ti质粒、诱癌质粒：大型，长200kb。 • 根癌土壤杆菌侵入到双子叶植物细胞中，Ti质粒片段与植物细胞核染色体组发生整合，破坏控制细胞分裂的激素调节系统，转变成癌细胞。 • 植物遗传工程研究的重要载体。外源基因可借DNA重组技术插入到Ti质粒中，进一步整合到植物染色体上，改变遗传性，培育优良品种。

35. 四、原核生物的质粒 • （五）、巨大质粒：200～300×106Da，比一般质粒大几十倍至几百倍。 • 根瘤菌属中发现，具有一系列固氮基因。

36. 四、原核生物的质粒 • （六）、降解性质粒：可编码降解复杂物质的酶，利用一般细菌难以分解的物质作碳源。如CAM(樟脑)质粒，OCT(辛烷)质粒，XYL(二甲苯)质粒，SAL(水杨酸)质粒，MDL(扁桃酸)质粒，NAP(萘)质粒和TOL(甲苯)质粒等。 • 仅在假单胞菌属中发现。

37. 第二节基因突变与基因重组 • 突变指遗传物质的核苷酸顺序突然发生了稳定的可遗传的变化。 • 基因重组指把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过重新组合，形成新遗传型个体。属于分子水平杂交。

38. 一、基因突变 • （一）、类型 • （二）、特点 • （三）、机制

39. （一）基因突变类型 • 按内部结构： • 1、基因突变（点突变）：一对或少数几对碱基发生改变。 • 2、染色体畸变：DNA的大段变化(损伤)，表现为插入、缺失、重复、易位和倒位。 • 按表型特征： • 1、形态突变型：细胞或菌落形态改变。 • 2、生化突变型--代谢途径发生变异而形态没有明显变化。分营养缺陷型、抗性突变型和抗原突变型。

40. （一）基因突变类型 • A、营养缺陷型：基因突变引起代谢过程中某种酶的合成能力丧失，必须在原有培养基中添加细胞不能合成的营养成分才能正常生长。 • B、抗性突变型：能抵抗有害理化因素，分抗药性、抗紫外线或抗噬菌体等。 • C、抗原突变型--细胞成分尤其是细胞表面成分(细胞壁、荚膜、鞭毛)的细微改变而引起抗原性变化。

41. （一）基因突变类型 • 3、致死突变型--基因突变导致个体死亡。 • A、条件致死突变型：突变后，在某种条件下可正常生长、繁殖并实现其表型，而在另一条件下却无法生长、繁殖。例如，E.coli的某些菌株可在37℃下正常生长，不能在42℃下生长等。 • B、其他突变型：如毒力、糖发酵能力、代谢产物的种类和产量以及对某种药物的依赖性等。

42. （一）基因突变类型 • 按分离： • 1、选择性突变：具有选择性标记，可通过某种环境条件使它们得到优势生长,从而取代原始菌株。如营养缺陷型或抗性突变型等。 • 2、非选择性突变：没有选择性标记，只有一些性状的数量差别。例如菌落大小、颜色深浅及代谢产物量的多少等。

43. （二）基因突变特点 • 1、不对应性--突变性状与原因无直接对应关系。 • 2、自发性--没有人为诱变因素，自发产生。 • 3、稀有性--自变频率低且稳定，多为10-6～10-9。 • 4、独立性--某一群体中，可发生抗青霉素的突变型，也可发生抗链霉素或任何其他药物的抗药性。某一基因的突变，不影响其他基因的突变率。突变对某一细胞是随机的，对某一基因也是随机的。

44. （二）基因突变特点 • 5、诱变性--诱变剂可提高自变频率10～105倍。 • 6、稳定性--遗传结构突变，新性状稳定遗传。 • 7、可逆性--由原始野生型基因变异为突变型基因的过程称为正向突变，反之称为回复突变或回变。实验证明，任何性状既有正向突变，也可发生回复突变。

45. （三）基因突变机制 • 1、诱变机制：显著提高突变频率的理化因子，称为诱变剂。 • A、碱基对置换：只涉及一对碱基被另一对碱基所置换，属于微小损伤，又称点突变。分为转换（嘧啶或嘌呤同类更换）、颠换（嘧啶或嘌呤异类更换） 。 • 某一种诱变剂，可同时引起转换与颠换，也可只具一个功能。

46. 碱基的置换（实－转换、虚－颠换）

47. （三）基因突变机制 • 直接置换诱变：直接与核酸碱基发生化学反应的诱变剂，不论在机体内或在离体条件下均有作用。种类很多，例如亚硝酸、羟胺和各种烷化剂(硫酸二乙酯、甲基磺酸乙脂、N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍、N-甲基-N-亚硝基脲、乙烯亚胺、环氧乙酸、氮芥等)。它们可与一个或几个核苷酸发生化学反应，引起DNA复制时碱基配对的转换，进一步使微生物发生变异。

48. （三）基因突变机制 • 间接置换诱变：通过活细胞的代谢活动使碱基类似物掺入到DNA分子中引起诱变。如5-溴尿嘧啶(5-BU)、5-氨基尿嘧啶(5-AU)、8-氮鸟嘌呤(8-NG)、2-氨基嘌呤(2-AP)和6-氯嘌呤(6-CP)等。 • 对休止细胞、游离噬菌体粒子或离体DNA分子不起作用 。

49. （三）基因突变机制 • B、移码突变：诱变剂使DNA分子中一个或少数几个核苷酸增添(插入)或缺失，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和翻译错误的一类突变。由移码突变所产生的突变株，称为移码突变株。

50. （三）基因突变机制 • C、染色体畸变：某些理化因子如X射线及烷化剂、亚硝酸等，引起DNA的大损伤，包括染色体结构的缺失（基因减少）、重复（基因增加）、插入、易位、倒位（基因排列顺序相反）和染色体数目变化。 • 染色体结构变化，分染色体内畸变和染色体间畸变。前者只涉及一条染色体，后者非同源染色体间的易位。