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第四章 蛋白质的共价结构

第四章 蛋白质的共价结构. 也就是蛋白质的一级结构，决定高级结构 即蛋白质中氨基酸的排列顺序. 蛋白质分子大小 结构层次 肽 一级结构的测定. 蛋白质的形状与大小. 球状蛋白. 蛋白质形状. 纤维状蛋白. 蛋白质是分子量很大的生物分子。对任一种给定的蛋白质来说，它的所有分子在氨基酸的组成和顺序以及肽链的长度方面都应该是相同的，即所谓 均一的蛋白质 。. 蛋白质分子量： 6000-10 6 下限：胰岛素或 RNA 酶 原因：胰岛素是不是蛋白质 大分子：烟草花叶病毒或细菌细胞壁 亚基与链 蛋白质中的氨基酸的平均分子量： 128

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第四章 蛋白质的共价结构

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  1. 第四章 蛋白质的共价结构 也就是蛋白质的一级结构，决定高级结构 即蛋白质中氨基酸的排列顺序 • 蛋白质分子大小 • 结构层次 • 肽 • 一级结构的测定

  2. 蛋白质的形状与大小 球状蛋白 蛋白质形状 纤维状蛋白 蛋白质是分子量很大的生物分子。对任一种给定的蛋白质来说，它的所有分子在氨基酸的组成和顺序以及肽链的长度方面都应该是相同的，即所谓均一的蛋白质。

  3. 蛋白质分子量：6000-106 • 下限：胰岛素或RNA酶 原因：胰岛素是不是蛋白质 • 大分子：烟草花叶病毒或细菌细胞壁 亚基与链 • 蛋白质中的氨基酸的平均分子量：128 水：18 所以：计算蛋白质中的氨基酸残基个数： = 蛋白质的分子量/110

  4. 蛋白质分子量的上下限是人为规定的，因为这决定于蛋白质和分子量概念的定义。蛋白质分子量的上下限是人为规定的，因为这决定于蛋白质和分子量概念的定义。 • 某些蛋白质是由两个或更多个蛋白质亚基(多肽链)通过非共价结合而成的，称寡聚蛋白质。有些寡聚蛋白质的分子量可高达数百万甚至数千万。

  5. 蛋白质的构象与结构层次 构象：蛋白质的空间结构、三维结构 在不破坏共价键（一级结构）的基础上可采取多种构象 但在生理条件只有一种或几种在能量上有利 因此：构象影响蛋白质的生理功能 决定于蛋白质的一级结构

  6. 蛋白质的结构层次 蛋白质的一级结构（化学结构） 一级结构就是蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序，即氨基酸的线性序列。在基因编码的蛋白质中，这种序列是由mRNA中的核苷酸序列决定的。一级结构中包含的共价键（covalent bonds）主要指肽键（peptide bond）和二硫键（disulfide bond） 蛋白质的二级结构 ——指蛋白质多肽链本身的折叠和盘绕方式 如α螺旋、β折叠等，主要：氢键

  7. 蛋白质的三级结构 • ——指多肽链上的所有原子（包括主链和侧链）在三维空间的分布。作用力：各种非共价键。紧密球状构象，最低的表面积与体积比，使蛋白质与环境的互作最小。 • 肌红蛋白 • 蛋白质的四级结构 • ——多肽亚基（subunit）的空间排布和相互作用。亚基间以非共价键连接。 • 血红蛋白

  8. 蛋白质功能的多样性 结构多样——功能多样 酶催化 调节，如激素、转录因子 转运，如血红蛋白 免疫， 储存、结构、运动、支架等

  9. 第四章 蛋白质的共价结构 也就是蛋白质的一级结构 即蛋白质中氨基酸的排列顺序 • 蛋白质分子大小 • 结构层次 • 肽 • 一级结构的测定 • 一级结构的功能

  10. 肽的结构 • 一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基之间失水形成的酰胺键称为肽键，所形成的化合物称为肽。 由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由多个氨基酸组成的肽则称为多肽。组成多肽的氨基酸单元称为氨基酸残基。

  11. 在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序 • 通常在多肽链的一端含有一个游离的-氨基，称为氨基端或N-端；在另一端含有一个游离的-羧基，称为羧基端或C-端。 • 氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为： Ser-Val-Tyr-Asp-Gln 不能颠倒，除非环肽 • 主链与侧链

  12. 肽键 肽键的形成

  13. 肽键 • 肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。 • 组成肽键的6个原子处于同一平面。 • 肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。 • 在大多数情况下，以反式结构存在。

  14. 肽键 • 肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。 • 在大多数情况下，以反式结构存在。

  15. 多肽的性质 1、熔点高——离子晶格——偶极离子 2、多肽的两性离解 末端氨基、羧基、侧链基团 3、多肽链的反应 茚三酮反应同氨基酸 双缩脲反应是肽键的特征反应

  16. 多肽可与多种化合物作用，产生不同的颜色反应。这些显色反应，可用于多肽的定性或定量鉴定。多肽可与多种化合物作用，产生不同的颜色反应。这些显色反应，可用于多肽的定性或定量鉴定。 • 如黄色反应，是由硝酸与氨基酸的苯基（酪氨酸和苯丙氨酸）反应生成二硝基苯衍生物而显黄色。 • 多肽的双缩脲反应是多肽特有的颜色反应;双缩脲是两分子的尿素经加热失去一分子NH3而得到的产物。 • 双缩脲能够与碱性硫酸铜作用，产生兰色的铜-双缩脲络合物，称为双缩脲反应。含有两个以上肽键的多肽，具有与双缩脲相似的结构特点，也能发生双缩脲反应，生成紫红色或蓝紫色络合物。这是多肽定量测定的重要反应。

  17. 天然存在的重要多肽 • 在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。 • 但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽。 • 如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。

  18. 四肽的结构

  19. α鹅膏蕈碱：环状8肽 真核生物中RNA聚合酶的抑制剂

  20. 催产素 加压素

  21. 催产素使子宫和乳腺平滑肌收缩，具有催产和促使乳腺排乳作用。加压素促进血管平滑肌收缩，升高血压，减少排尿。催产素使子宫和乳腺平滑肌收缩，具有催产和促使乳腺排乳作用。加压素促进血管平滑肌收缩，升高血压，减少排尿。 脑啡肽具有强烈的镇痛作用（强于吗啡），不上瘾。 +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO-+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO- Met-脑啡肽Leu-脑啡肽

  22. L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-Val  L-Orn L-Orn  L-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu 短杆菌肽S(环十肽) 由细菌分泌的多肽，有时也都含有D-氨基酸和一些不常见氨基酸，如鸟氨酸（Ornithine, 缩写为 Orn）。

  23. 谷胱甘肽（GSH）： 全称为γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸。其巯基可氧化、还原，故有还原型（GSH）与氧化型（GSSG）两种存在形式。

  24. 谷胱甘肽的生理功用： • 解毒作用：与毒物或药物结合，消除其毒性作用； • 参与氧化还原反应：作为重要的还原剂，参与体内多种氧化还原反应； • 保护巯基酶的活性：使巯基酶的活性基团-SH维持还原状态； • 维持红细胞膜结构的稳定：消除氧化剂对红细胞膜结构的破坏作用。

  25. A链 —S————S—— HGly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Ala-Ser-Val-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-AsnOH 1 5 6 7 10 11 15 20 21 S S B链 S S HPhe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His- Leu-Val- Glu- Ala- Leu- Tyr –Leu -Val-Cys-Gly 1 5 7 10 15 19 20 Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-AlaOH 21 25 30 • 胰岛素（Insulin）由51个氨基酸残基组成，分为A、B两条链。A链21个氨基酸残基，B链30个氨基酸残基。A、B两条链之间通过两个二硫键联结在一起，A链另有一个链内二硫键。

  26. 第四章 蛋白质的共价结构 也就是蛋白质的一级结构 即蛋白质中氨基酸的排列顺序 • 蛋白质通论 • 肽 • 一级结构的测定

  27. 3、蛋白质的一级结构的测定 • 蛋白质的一级结构(Primary structure)包括组成蛋白质的多肽链数目. • 多肽链的氨基酸顺序， • 以及多肽链内或链间二硫键的数目和位置。 • 其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。

  28. 蛋白质一级结构的测定 • 蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有10多万种不同蛋白质的一级结构被测定。

  29. 1,测定蛋白质的一级结构的要求 • 1，样品必需纯（>97%以上）； • 2，知道蛋白质的分子量； • 3，知道蛋白质由几个亚基组成； • 4，测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。 • 5，测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。

  30. 2，测定步骤 蛋白质一级结构的测定 • (1)，多肽链的拆分。 • 由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。

  31. 2，测定步骤 蛋白质一级结构的测定 • (1)，多肽链的拆分。 • 几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基).

  32. 2，测定步骤 蛋白质一级结构的测定 • (2)，测定蛋白质分子中多肽链的数目。 • 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。

  33. 2，测定步骤 蛋白质一级结构的测定 • (3)，二硫键的断裂 • 几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂（如碘乙酸）保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。

  34. 2，测定步骤 蛋白质一级结构的测定 • 可以通过加入盐酸胍方法解离多肽链之间的非共价力；应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键。

  35. 巯基（-SH）的保护 1 作用：这些反应可用于巯基的保护。

  36. 蛋白质一级结构的测定 • (4)测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比；

  37. 2，测定步骤 蛋白质一级结构的测定 • (5)分析多肽链的N-末端和C-末端。

  38. 末端基氨基酸测定 • 多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸。 • 在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。

  39. 末端基氨基酸测定 二硝基氟苯（DNFB）法 • Sanger法。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。 • 在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。

  40. DNFB法分析N-端氨基酸残基

  41. 末端基氨基酸测定 丹磺酰氯法（DNS） • 在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。 • 此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9mol。

  42. 肼解法 末端基氨基酸测定 • 此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸都则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。

  43. 肼解法分析C-端氨基酸残基

  44. 末端基氨基酸测定 氨肽酶法 • 氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。 • 根基不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。 • 最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。 • 敏感性？

  45. 末端基氨基酸测定 羧肽酶法 • 羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解。根基不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。 • 目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。 • 羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。

  46. 2，测定步骤 蛋白质一级结构的测定 • (6)多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。

  47. 多肽链的选择性降解 • 酶解法: • 胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶，葡萄球菌蛋白酶

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