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实验三

实验三. RT-PCR. 实验原理. 逆转录 理论依据：真核生物结构基因有 内含子 基因在 转录水平 的表达是不同的 实验原理：以 mRNA 为模版，逆转录获得 cDNA 。 PCR 理论依据：半保留复制原理 DNA 双链碱基互补 在不同温度下变性与复性 实验原理：以 cDNA 为模版经复制以几何级数扩增同一序列，获得大量相同 DNA 序列. 逆转录原理. 理论依据 真核生物基因多为 断裂基因 ，编码区不连续，需经转录后加工，才能成为成熟 mRNA 。

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实验三

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Presentation Transcript

  1. 实验三 RT-PCR

  2. 实验原理 • 逆转录 • 理论依据：真核生物结构基因有内含子 基因在转录水平的表达是不同的 • 实验原理：以mRNA为模版，逆转录获得cDNA。 • PCR • 理论依据：半保留复制原理 DNA双链碱基互补 在不同温度下变性与复性 • 实验原理：以cDNA为模版经复制以几何级数扩增同一序列，获得大量相同DNA序列

  3. 逆转录原理 • 理论依据 • 真核生物基因多为断裂基因，编码区不连续，需经转录后加工，才能成为成熟mRNA。 • 以真核成熟mRNA为模板合成cDNA，则获得有连续氨基酸编码的DNA序列，无需转录后加工，可在原核细胞中表达。 • 基因转录水平与分化、调节、疾病等相关

  4. 内含子 外显子

  5. AAAAAAAAA- 3’ 逆转录酶 AAAAAAAAA- 3’ • 实验原理 • 以mRNA为模板、根据polyA尾设计的Oligo(dT)为引物，在逆转录酶催化下合成cDNA。 agTTTTT- 5’ agTTTTT- 5’

  6. PCR原理 • 理论依据 • DNA双链在体内外均可解链，分别作为模版指导子链的合成。 • DNA双链碱基互补，以氢键相连 • 随着温度的升高， DNA双链间的氢键断裂，DNA变性成单链。随着温度缓慢降低，双链重新形成，DNA复性。

  7. 实验原理： 94—95℃ • DNA模板(双链) 变性解链(单链) • 单链DNA模板与引物退火 两段引物分别与待扩增靶DNA两端互补决定了扩增产物的大小和特异性。 引物量＞模板量 故引物与模板的退火远大于 引物短，不易缠绕 模板双链自身的退火 • 引物3’-OH在DNA聚合酶作用下沿单链模板延伸 模板方向 3’→ 5’ 延伸方向 5’→ 3’

  8. 催化酶 • 逆转录酶 • 天然逆转录酶具有逆转录、RNase H 及DNA聚合酶活性。为避免RNase H对反应体系中模板RNA的破坏，多被缺失。 • 逆转录酶有禽源与鼠源两种。禽源逆转录酶的最适反应温度高于鼠源，有利于克服RNA的二级结构，因此反应效率更高。 • 耐热DNA聚合酶 • 嗜热水生菌中获得的Taq酶，缺乏校读活性，突变频率千分之一，适合检测基因转录水平。 • 具有校正活性的耐热DNA聚合酶（高保真DNA聚合酶），适合扩增需克隆的基因。

  9. 引物 • 逆转录引物 • Olig(dT)可与mRNA的polyA互补，特别在其3’端添加两个随机核苷酸的锚定引物，在引导合成cDNA时效率很高。 • 随机引物对RNA种类没有选择性，特异性低。且随机引物与mRNA结合部位不固定，因此不适宜全长cDNA合成。只有当mRNA缺乏polyA或RNA模板完整性较差时，选用随机引物合成cDNA 。 • PCR引物 • 引物决定退火温度 退火温度＝A/T数目×2＋G/C数目×4 • 两条引物总浓度应为1pmol/μl左右

  10. 操作步骤 • 逆转录 • PCR

  11. (一) 逆转录 • 取消毒的0.5ml离心管，加入下列成分： 总RNA 1-5μg （根据浓度计算RNA模板要用量） Oligo(dT)引物 1μl dNTP Mix (10mM) 1μl 加入无RNA酶的ddH2O至总体积15μl，混匀。 • 置65℃保温5分钟，放于冰上。再加入下列成分： 5×first-Strand Buffer 4μl MMLV(逆转录酶) 1μl • 混匀，42℃保温1～1.5小时。70℃保温15分钟。

  12. 逆转录步骤说明 • 65℃条件下，RNA二级结构被破坏。变性后置于冰上迅速冷却，可防止RNA二级结构的再形成，有利于RNA模板与引物的结合。 • 70℃可导致逆转录酶变性失活，防止其对后续反应的干扰。同时也可分离cDNA第一链与模板mRNA。

  13. (二) 特定基因的PCR扩增 • 取消毒的0.5ml微量离心管，加入下列成分： ddH2O 16.5 μl 10×PCR Buffer 2.5 μl dNTP(2.5mM each) 2 μl 逆转录产物 1 μl 引物混合物(10μM each) 1 μl Taq DNA polymerase 1 μl • 混匀，加石蜡油1滴，离心4000转1分钟。 • 热启动： 94℃变性3min • 扩增程序：94℃变性30sec，55℃复性30sec，72℃延伸1min，共反应35个循环。

  14. PCR步骤说明 • 以GAPDH作为对照组扩增时应与实验组反应体系一致，只是引物不同。可先配制不含引物的双倍反应液，均分为两管，再分别加入引物。这样可保证两个反应体系的准确性。 • 在94℃开始PCR反应称为热启动，可防止缓慢升温时发生非特异性扩增。标准的热启动是在反应体系置于94℃后再加酶，本操作方法更为简单。 • 热启动耐热DNA聚合酶在94℃加热后才释放活性。 • 不同的热循环仪升降温速度不同，对扩增程序的要求可能有所不同。一般加快升降温速度能缩短PCR反应的时间，但可能影响PCR反应的效率。

  15. 电泳观察反应结果 • 制备1.％琼脂糖凝胶 • 取5μl PCR产物，加1μl加样缓冲液，混匀，上样。 • 电泳，紫外灯下观察实验结果。 • 可同时加入分子量标准品进行电泳，以鉴定PCR产物的长度。

  16. GAPDH片断扩增电泳结果

  17. IL-1βIL-1IL-4IL-10IL-8 A B A B A B A B A B 18S IL 电泳结果图示范（凝胶成像）

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