第二章 发酵培养基设计及制备

1. 第二章 发酵培养基设计及制备

2. 解说培养基配方 • PDA培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1000ml, pH自然,0.1Mpa灭菌20min； • 种子培养基：水解糖30kg、蛋白胨1kg、(NH4)2SO4 2kg、Na2HPO4 1kg、MgSO40.05kg、水500kg。pH自然,100℃灭菌2h； • 发酵培养基：水解糖60kg、豆饼粉1.6kg、(NH4)2SO4 4kg、Na2HPO4 2kg、MgSO40.1kg、水1000kg。pH自然,100℃灭菌2h；

3. 提要： • 一、发酵培养基的特点 • 二、发酵培养基的原料 • 三、发酵培养基的制备

4. 原种培养基 种子培养基 发酵培养基 发酵培养基 一、发酵培养基的特点 1、概念 发酵培养基：指为发酵过程设计的符合不同阶段菌种代谢要求的营养基质的组合和理化指标设置 。 2、发酵培养基的作用 满足菌体的生长 促进产物的形成

5. 3、发酵培养基的要求 ① 培养基成份能够满足产物最经济的合成。 ②原料来源广泛、成本低廉、性能稳定; ③主要原料一般需经转化后使用，发酵后副产物少； ④培养基物料组成应能满足工艺要求,产物分离要求； ⑤制造规模大，采用灭菌工程灭菌。

6. 二、发酵培养基的原料 1、碳源 作用 提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需的碳成分 提供合成目的产物所必须的碳成分 来源 糖类、淀粉、油脂、有机酸、烷烃

7. （1）常用的糖类 ① 葡萄糖 所有的微生物都能利用葡萄糖, 但是会引起葡萄糖效应. • 工业上常用葡萄糖为淀粉水解糖，但是糖液必须达到一定的质量指标

8. 不同的制糖工艺生产的糖液质量

9. ② 糖蜜 糖蜜是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产物。 糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达50%～75%。一般糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜葡萄糖蜜。

10. 不同 加工方法对甘蔗糖蜜的影响

11. 例：谷氨酸发酵 有害物资：胶体成分（起泡、结晶）、钙盐（结晶） 生物素（发酵控制） 预处理：澄清→脱钙→脱除生物素 例：柠檬酸发酵 有害物质：铁离子含量高（导致异柠檬酸的生成） 预处理：→黄血盐 糖蜜使用的注意点： 除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的，但是许多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。

12. 使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类。使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类。 缺点：难利用、发酵液比较稠、一般>2.0%时加入一定的α-淀粉酶成分比较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等等。 优点：来源广泛、价格底，难利用，可以解除葡萄糖效应。 （2）淀粉、糊精 来源于农作物：大米、面粉、薯类等原料。

13. 例：地衣芽孢杆菌生产α-淀粉酶 碳源对生长和产酶的影响 碳源 细胞量 α-淀粉酶 葡萄糖 4.2 0 蔗糖 4.02 0 糊精 3.06 38.2 淀粉 3.09 40.2

14. (半纤维素酶) (1.5g麸皮)

15. 嗜碱芽胞杆菌(AC-2)中碳源对碱性纤维素酶分泌的影响嗜碱芽胞杆菌(AC-2)中碳源对碱性纤维素酶分泌的影响 结果：各种碳源相差不大 推论：该菌种的碱性纤维素酶为组成型

16. 附：淀粉水解糖的制备方法 • 淀粉可分为四大类：谷类淀粉、薯类淀粉、豆类淀粉和其他类淀粉等。 • 淀粉通常以颗粒状态存在于作物中，其颗粒大小因淀粉类型而异，谷物大米淀粉颗粒直径3-8μm；木薯淀粉在下--35μm。淀粉颗粒含直链和支链淀粉两种。

17. 谷物淀粉和薯类淀粉含直链淀粉17-27%，其余为支链淀粉；而粘玉米、糯米和高梁不含直链淀粉，全部为支链淀粉。谷物淀粉和薯类淀粉含直链淀粉17-27%，其余为支链淀粉；而粘玉米、糯米和高梁不含直链淀粉，全部为支链淀粉。 • 直链淀粉以α-1，4键缩聚而成，聚合度为100—60000；支链淀粉支叉位置以α-1，6键，其余以α-1，4键缩聚而成，聚合度为1000—3000000。 • 淀粉水解： • 淀粉→ 糊精→低聚糖→麦芽糖→葡萄糖 碘液反应

18. 淀粉糊 starch paste ：淀粉在水介质中,通过用化学试剂或升温等方法使淀粉发生膨胀和胶状扩散而形成 的粘性物质。 • 糊化 gelatinization ：淀粉转变成淀粉糊的过程。 • 胶凝 gelling ：糊化淀粉在水分散体里凝固,通常在冷却时发生。 • 老化 retrogradation 淀粉或其衍生物的凝胶体,因沉淀析出或由浓缩而逐渐成为非可逆的不溶性水分散体。

19. 淀粉水解糖的制备方法 • （1）酸解法：以酸为催化剂，在高温高压下将淀粉转化为葡萄糖的过程。 • 特点：生产方便、设备简单，水解时间短，生产能力大；但在高温、高压及一定酸度下有一定的副反应；对淀粉颗粒有一定的要求（颗粒度要小，大小均匀）；淀粉浓度也不宜过高；设备需耐高温、高压、腐蚀。

20. （2）酶解法： • 利用а-淀粉酶作用成糊精及低聚糖，称“液化”；利用α-糖苷酶（糖化酶）进一步水解成为葡萄糖，称“糖化”。此法也称双酶法。 • 特点：条件温和；副产物少；水解淀粉浓度高；能丰富培养液的营养（酶或细胞）；品质高（色浅、纯净、无杂味）。如：细菌а-淀粉酶作用，85—90摄氏度，pH6.0-7.0;糖化酶50-60摄氏度，pH3.5-5.0。

21. α-淀粉酶alpha-amylase 酶：通过任意水解淀粉 的α-1,4-葡萄糖苷键,导致淀粉部分解聚。系统命名为α-1,4葡萄糖葡聚糖水解酶。标准号码为(E.C) 3.2.1.1。 • α-糖苷酶alpha-glucosidase 酶：通过切断α-1,4-葡萄糖苷链使麦芽糖水解成两分子D-葡萄 糖。系统命名为α-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶。标准号码为(E.C)3.2.1.20。 • β-淀粉酶beta-amylase 酶：作用于淀粉的α-1,4-D葡萄糖苷键, 使麦芽糖单位从链的非还原尾端逐步释放。系统命名为α-1,4-D葡聚糖麦芽糖水解酶。标准号码为(E.C)3.3.1.2。 • 葡萄糖淀粉酶 glucamylase 酶：从淀粉链的1,4链的非还原末端释放出D-葡萄糖单位及水解α-1,6-支链键,将淀粉完全转化为D-葡萄糖。系统命名为α-1,4-D葡聚糖葡萄糖水解酶, 标准号码 为(E.C)3.3.1.3。

22. （3）酸酶结合法： • 酸酶法：先将淀粉酸解成糊精或低聚糖，再利用酶水解成葡萄糖。 • 特点：速度快，生产效率高，品质好。适用于淀粉颗粒坚实，可高淀粉浓度水解。如：玉米、小麦淀粉。 • 酶酸法：先用酶液化淀粉，再酸解成葡萄糖。 • 特点：淀粉浓度高，生产易控制，时间短，有一定副产物。适宜于淀粉颗粒大小不一（如碎米）。

23. 淀粉酸水解工艺流程举例： • 原料（淀粉、水、盐酸）→调浆→糖化→冷却→中和、脱色→过滤除杂→糖液。 • 淀粉水解糖质量指标： • （1）糖液中的还原糖含量要达到发酵用糖浓度要求； • （2）糖液洁净，浅黄或黄绿色，有一定的透光度； • （3）不含糊精；（易形成泡沫、利用率低） • （4）不可变质。

24. 双酶水解法举例： 1、调浆槽；2、，8过滤器；3，9，14，17泵；4，10喷射加热器；5缓冲器；6液化层流罐；7液化液贮槽；11灭酶罐；12板式换热器；13糖化罐；15压滤机；16糖化暂贮槽；18贮糖槽

25. 2、氮源 氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、核酸等）和含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类：有机氮源和无机氮源。 无机氮源 种类：氨盐、硝酸盐和氨水 特点：微生物对它们的吸收快，所以也称之谓迅速利用的氮源。但无机氮源的迅速利用常会引起pH的变化如： (NH4)2SO4 → 2NH3 + 2H2SO4 NaNO3 + 4H2→ NH3 + 2H2O + NaOH

26. 无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质，如硫酸胺，若代谢后产生碱性物质的则称为生理碱性物质，如硝酸钠。无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质，如硫酸胺，若代谢后产生碱性物质的则称为生理碱性物质，如硝酸钠。 正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的pH有积极作用。 无机氮源作用： 满足菌体生长 稳定和调节发酵过程中的pH

27. 毛霉产蛋白酶的发酵生产 初始pH的影响: pH偏酸比较好，中性蛋白酶影响大

28. 无机氮源的影响： 硫酸铵>硝酸铵>硝酸钠>尿素

29. 有机氮源 来源：工业上常用的有机氮源是花生饼 粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋 白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒 糟等一些廉价的原料。 成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机 盐及生长因子。 例 玉米浆： ①可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸 ②较多的乳酸 ③硫、磷、微量元素等

30. 氮源使用的一些相关问题： • 有机氮源和无机氮源应当混合使用 早期：容易利用易同化的氮源—无机氮源 中期：菌体的代谢酶系已形成、则利用蛋白质 • 有些产物会受氮源的诱导和阻遏 例： 蛋白酶的生产 • 有机氮源选取时也要考虑微生物的同化能力

31. 作用：各种不一样 来源：C、N源，以盐的形式补充 用量：根据具体的产品，以实验决定。 使用注意点 A. 对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和 微量元素在发酵过程中必须加以考虑 3、无机盐和微量元素 例：铁离子 青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于20μg/ml 发酵罐必须进行表面处理

32. B、使用时注意盐的形式（pH的变化） 例：黑曲酶NRRL-330,生产α-淀粉酶，P对酶活的影响 pH 酶活 不加 4.25 120min 加 K2HPO4 5.45 30min 加 KH2PO4 4.62 75min

33. 4、生长因子、前体和产物促进剂 生长因子 从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。 如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷型，以生物素为生长因子,生长因子对发酵的调控起到重要的作用 。 有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源含有较多的B簇维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少的生长因子

34. 前体 前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接使微生物在生物合成过程中合成到产物物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。 苯乙酸:分子量136 青霉素：分子量356

35. 作用：前体有助于提高产量和组份 用量：前体的用量可以按分子量衡算，具体使用有个转化率的问题 例：6000单位/ml的青霉素G,需要多少苯乙酸 青霉素＝6000×0.6（微克）＝36mg/ml 苯乙酸＝（36×136）/356=13.8mg/ml=1.38% 实使用时的转化率在46-90%之间 例某厂单耗为：0.337（kg/10亿青霉素） 转化率为：0.6/(0.337×36/13.8)=68% 用法：前体使用时普遍采用流加的方法 前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利。苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07% 前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化，流加也有利于提高前提的转化率

36. 产物促进剂 所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。

37. 促进剂提高产量的机制： （1）有些促进剂本身是酶的诱导物； （2）有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性； （3）有些对酶的表面失活有保护作用； （4）有些沉淀或螯合有害的重金属离子。 （5）有些机制还不完全清楚。

38. 5、水 不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚大，对于发酵工厂来说水源是至关重要的。 水源质量的主要考虑参数包括：pH值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。 对于酿造行业，水的重要性不言而喻。 对于常规发酵，可靠、持久，能提供大量成分一致清洁的水。

39. 三、发酵培养基的设计与制备 • 1、培养基设计的重要性 • 对现存发酵培养基引用吸收的必要验证； • 对菌种发酵条件认识的必需途径； • 发酵技术建立的一个重要步骤； • 发酵生产成本控制的重要渠道。

40. 2、培养基的设计的基本程序 • （1）从生化反应的基本原理来推断和计算出适合某一菌种的培养基配方； • 1）列出细胞生长和产物形成的化学反应计算的平衡 • 碳源和能源+氮源+其他需要→细胞+产物+CO2+H2O+热量 • 获得一定数量的细胞生产所需的营养物的最低数量； • 计算出形成产物时所需的底物数量；

41. 2）测出微生物的元素组成 包括：C、H、O、N、S、P、Mg和K 3）根据发酵过程中物质平衡计算各类物质的量 CcHhOoNnPpSs +(c+0.25h-0.5 o+1.25n+1.25p+1.5s)O2→ cCO2+(0.5h-0.5n-1.5p-s)H2O+nHNO3+pH3PO4+sH2SO4

42. （2）用生物化学、细胞生物学、微生物学等的基本理论，参照前人所使用的较适合某一类菌种的经验配方；（2）用生物化学、细胞生物学、微生物学等的基本理论，参照前人所使用的较适合某一类菌种的经验配方； • 菌种的同化能力 • 代谢的阻遏和诱导 • 合适的C、N比 C/N=100∶0.2～2.0 • pH的要求

43. （3）结合所用菌种和产品的特性，采用摇瓶、玻璃罐等小型发酵设备，按照一定的实验设计和实验方法选择出较为适合的培养基。

44. 单因子实验 • 合理的实验方法 正交实验设计 多因子实验 均匀设计 响应面分析等。 3、培养基成分组成实验设计 培养基成分的含量最终都是通过实验获得的

45. 举例一：维生素D高产菌培养基的优化 （1）原培养基

46. （2）碳、氮源组合的单一因子实验

47. 碳源：乙酸钠 0.2% 结果： 氮源：氯化铵 0.2% 酵母膏 0.03% 无机盐: 复合无机盐0.05% • 单因子实验确定适宜的碳氮源培养基成分

48. （3）正交设计多因素优化的配方

50. 改进后培养基 原培养基 改进后培养基的发酵结果 碳酸钠 氯化铵 酵母膏