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La GFP: Le cadeau de la méduse

La GFP: Le cadeau de la méduse. I. Les premières avancées sur la GFP (in vivo) A. La découverte d’un chercheur B. Les protéines responsables de la fluorescence II. Structure, Chromophore et Mutants A. La structure et le chromophore B. La création des différents mutants

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Presentation Transcript

  1. La GFP:Le cadeau de la méduse

  2. I. Les premières avancées sur la GFP (in vivo) A. La découverte d’un chercheur B. Les protéines responsables de la fluorescence II. Structure, Chromophore et Mutants A. La structure et le chromophore B. La création des différents mutants III. Les applications possibles de la GFP A. Les diverses applications B. Un vecteur d’expression fondamental

  3. I. Les premières avancées sur la GFP (in vivo) • OsamuShimomura • 1960: Doctorat en chimie organique à l’Université de Nagoya (Japon) • Isole une protéine responsable de la brillance chez le mollusque Cypridina • Frank Johnson (Université de Princeton, New Jersey) • 1961: début des travaux sur une méduse bioluminescente

  4. I. Les premières avancées sur la GFP (in vivo) • Aequorea victoria (« cristal jelly ») • Côtes du Nord-Ouest du Pacifique • Organisme bioluminescent • Particularité: émission d’une lumière verte à la base de l’ombrelle (anneau) • Travail sur 10 000 spécimens

  5. I. Les premières avancées sur la GFP (in vivo) • Protéine bioluminescente ou photoprotéine • Inhibition réversible à certains pH Organes lumineux (anneaux) Faible luminescence tampon pH4 filtration Pas de luminescence Extrait (pH 4) NaHCO 3 Faible luminescence Extrait (pH neutre) Eau de mer soit Ca 2+ Forte luminescence

  6. I. Les premières avancées sur la GFP (in vivo) 1962: extraction de 2 protéines • Aequorine: 465 nm - apo-aequorine (189 aa, 21KDa) - O moléculaire - chromophore « coelenterazine » (423Da) • GFP 508 nm Pourquoi la méduse ne s’irradie que de vert? 2

  7. I. Les premières avancées sur la GFP (in vivo) • 1969: aequorine AF-350 (coelenteramine) • 1972: Dénaturation (urée + 2-mercaptoéthanol) 2-aminopyrazine (Cypridina)

  8. I. Découverte de la GFP et sa fluorescence Aequorine (coelenteramide) 2X Ca2+ GFP O2 O2 O2 * Ca2+ CO2 Aequorine Aequorine (coelenterazine) O2 Apoaequorine Ca2+

  9. I. Les premières avancées sur la GFP (in vivo) GFP: réaction de fluorescence • 1979: découverte du chromophore de la GFP et de sa structure • 10 décembre 2008: Prix Nobel de Chimie

  10. II. Structure, Chromophore et Mutants • 238 Acides aminés, dont 3 formant le chromophore: la sérine 65, la tyrosine 66 et la glycine 67.

  11. II. Structure, Chromophore et Mutants • 11 Feuillets β, 4 hélices α, et une formation en baril.

  12. II. Structure, Chromophore et Mutants Structure tertiaire GFP Chromophore

  13. Cyclisation Déshydratation Oxydation

  14. II. Structure, Chromophore et Mutants • Premier mutant : le « Timer »

  15. II. Structure, Chromophore et Mutants • Autres mutants: les variantes de couleurs

  16. II. Structure, Chromophore et Mutants Utilisation: le multi-marquage

  17. III. Les applications possibles de la GFP Martin Chalfie • 1988: Séquençage de la GFP • 1990: Insertion de la GFP chez E.coli • 2008: Prix Nobel de Chimie Expression de la GFP dans E.coli, sous lumière UV

  18. III. Les applications possibles de la GFP • Marquage cellulaire : Insertion du gène codant la GFP dans une cellule (transfection) Tri des cellules (transformées ou non) par cytométrix en flux

  19. III. Les applications possibles de la GFP • Marquage moléculaire : Synthèse d’une protéine de fusion • (protéine d’intérêt/GFP) Suivi de la protéine de fusion par microscopie à fluorescence

  20. III. Les applications possibles de la GFP • Gène rapporteur : Synthèse d’une protéine possédant • une activité connue et détectable (par exemple la fluorescence). • Etude de l’efficacité de promoteurs spécifiques, et les facteurs influant sur l’expression d’un gène d’intérêt • Vecteur de clonage : Expression et multiplication d’un fragment d’intérêt dans un hôte. Production à grande échelle de protéines (hormones de croissance par exemple)

  21. III. Les applications possibles de la GFP CMV MCS pUC ori EGFP Fragment d’intérêt SV 40 Poly A Kan pEGFP – N1

  22. III. Les applications possibles de la GFP MIAM ! C. Elegans produisant la protéine de fusion C. Elegans

  23. III. Les applications possibles de la GFP • Après insertion de la GFP et de ses mutants au sein de différentes bactéries • (Roger Tsien)

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