第十三章 遗传工程

1. 第十三章　遗传工程 基因工程或遗传工程，是将分子遗传学的理论与技术相结合，用来改造、创建动、植物新品种，工业化生产生物产品，诊断和治疗人类遗传疾病的一个新领域。 基础：分子遗传学理论 工具：分子生物学、核酸生物化学以及微生物遗传学的现代方法和手段 广义遗传工程包括：细胞工程、染色体工程。 狭义遗传工程是指：基因工程(重组DNA技术)。 克隆羊“多莉”

2. 第一节 细胞工程 细胞工程：细胞水平研究细胞融合、核移植、细胞器置换等现代技术。 一、细胞融合（体细胞杂交） 体细胞A+体细胞B（体外理化因素诱导融合）→异种融合体→杂种细胞→杂种个体。 细胞全能性：分化后体细胞具有潜在分裂能力，在一定的条件下离体培养，经分化发育成为完整生物体。 一般植物细胞具有全能性，动物细胞不明显。 （一）植物体细胞融合（原生质体融合） 1、分离与去壁 材料（叶片、根尖、愈伤组织等） →果胶酶处理组织（使细胞分离）→纤维素酶处理（分解细胞壁）→过滤去渣→低速离心收集原生质体，培养待用。

3. 2．诱导融合 两种原生质体按一定比例混合，加入诱导剂，常用 （1）硝酸钠：1972年卡尔逊成功诱导得到第一株烟草种间杂种，诱导率低。 （2）聚乙二醇（PEG），1972年以后，提高10－35％， （3）电场诱导，1981年，不对称电极，双向电泳，使细胞排列，短脉冲击破细胞而融合。得到同源融合体和异源融合体 3、杂种细胞筛选

5. 4、诱导杂种细胞分裂 5、分化成种间杂种植株 成功：烟草种间、烟草与马铃薯、马铃薯与番茄、胡萝卜与羊角芹等。 （二）动物细胞融合 1、分离 胰蛋白酶或机械方法。 2、诱导融合 除化学、物理方法外，可用病毒。仙台病毒 3、杂种细胞筛选：机械或选择培养基。 成功：人与鼠、人兔、鼠鸡、人蛙等。 应用：（1）基因定位；（2）培养单克隆抗体生产某种抗体。1975年英国柯勒和米尔斯坦成功将淋巴细胞和肿瘤细胞融合得到杂种细胞在体外能大量增殖并分泌专一抗体。

6. 二、细胞核和细胞器移植 （一）细胞核移植 供体:提供核，常为胚细胞；受体：去核细胞，常卵细胞 1、得到去核卵细胞 从蛙体挤出成熟但未受精卵→用针刺破动物半球（模拟受精，激活卵）→用玻璃针刺入卵细胞，挑出核，去核后卵从胶囊中取出。 2、取供体核：胚囊期蛙胚细胞用微吸管吸出。 3、移植 实例：1962年高尔登，蝌蚪肠上皮细胞核移入同种卵（核用UV杀死）→成体蛙。 鲤鱼核＋鲫鱼去核卵细胞→杂种鱼；草鱼核＋团头鲂去核卵细胞→杂种鱼。

7. 克隆动物：将处于终末分化细胞核移入去核卵细胞中，植入雌体子宫中 发育为个体。 研究简介： 1938年汉斯、斯皮漫建议用成年细胞核植入卵中进行哺乳动物克隆。 1984年斯蒂恩、威拉德森宣布用胚胎细胞克隆一头羊； 1996年，威尔穆特研究小组克隆羊“多莉”诞生 （利用6岁成年母羊乳腺细胞核）——克隆动物。

8. 1998年，美国夏威夷大学用一只实验鼠的细胞 克隆了3代共50只实验鼠。 2000年，美国用无性繁殖技术克隆猴子 “泰特拉”，意味克隆人体已无技术障碍。 2001年，美国宣布首次克隆成功处于早期阶段 的人体胚胎。 2002年，12 月26日“雷尔”教女法国研究者布里吉特.瑟利耶宣布克隆出第一个女婴（夏娃）。

9. 我国核移植和克隆动物： 60年代，生物学家童第周对鲤鱼、鲫鱼进行细胞核移植。 1990年5月，西北农业大学畜牧所克隆一只山羊。 1992年，江苏农科院克隆一只兔子。 1993年，中科院发育生物学研究所与扬州大学农学院合作，克隆 一只山羊。 1995年7月，华南师大与广西农大合作，克隆一头奶牛、黄牛 杂种牛。 1995年10月，西北农大克隆6头猪。 1996年12月，湖南医大克隆6只老鼠。同年中国农科院畜牧所克隆一头公牛犊。（以上为胚胎细胞克隆 研究） 1997年后多种动物克隆。 克隆动物面临许多问题，老年化、物种稳定、伦理等

10. （二）细胞器移植 1、叶绿体 1973年卡尔逊 白花烟草原生质与烟草的叶绿体混合→绿色烟草 叶绿体＋鸡卵细胞混合→鸡卵细胞成活7d。 启示：提高光合效率；动物异养→自养。 2、线粒体 带有抗红霉素基因的链孢酶的线粒体移入草履虫，能抗抗红霉素。

11. 第二节 基因工程 在分子水平上，采取工程建设方式，按照预先设计的蓝图，借助于实验室技术将某种生物的基因（基因组）或人工合成的基因，转移到另一种生物细胞中，使后者定向获得新的遗传性状的一门技术。 基础：分子遗传学理论 工具：分子生物学、核酸生物化学以及微生物遗传学的现代方法和手段 基因工程技术的建立，使所有实验生物学领域产生巨大的变革——定向改变生物遗传学特性，甚至产生新的生物。

12. 一、基因工程发展 1971年　史密斯（Smith H. O.）等人从细菌中分离出的一种 限制性酶→酶切病毒DNA分子，标志着DNA重组 　　　　时代的开始。 1972年　伯格（Berg P.）等用限制性酶分别酶切猿猴病毒和 λ噬菌体DNA，将两种DNA分子用连接酶连接起来 　　　　得到新的重组DNA分子。 1973年　科恩（Cohen S.）等进一步将酶切DNA分子 与质粒DNA连接起来，并将重组质粒转入E. cloi细胞。 目的基因与载体结合并转入受体细胞， 基因工程成为可能

13. 1982年，美国食品卫生和医药管理局批准，用基因工程在细菌中生产人的胰岛素投放市场。1982年，美国食品卫生和医药管理局批准，用基因工程在细菌中生产人的胰岛素投放市场。 1985年，转基因植物获得成功（利用基因过程技术将目的基因转入植物体内并在其中表达，这种植物）。 1986年，穆勒斯发明了PCR技术， 专利转让达3亿美元。 1990 年9月14日是基因治疗的诞生日。 在美国马里兰州的一个医疗中心进行第一例基因治疗临床试验。一个4岁的小女孩戴斯瓦(A.eSilva)，患有严重综合免疫缺失症（SCID）。将腺苷酸脱氨酶（ADA）基因转入骨髓细胞，再送回病人体内，基因治疗SCID 获得初步效果。 1994年，延熟保鲜的转基因番茄商品生产。

14. 二、基因工程研究内容 1．从细胞和组织中分离DNA，或人工合成基因； 2．限制性内切酶酶切DNA分子，制备DNA片段； 3．将酶切DNA分子与载体DNA连接 →构建能在宿主细胞内自我复 制的重组DNA分子； 4．把重组DNA分子引入宿主受体细胞→ 复制； 5．重组DNA随宿主细胞的分裂而分配到子细胞→ 建立无性繁殖系(clone) 或发育成个体； 6．从细胞群体中选出所需要的无性繁殖系→ 并使外源基因在受体细胞中 正常表达，翻译成蛋白质等基因产物、回收；或筛选出获得定向性状 变异的个体。 即三步（1）目的基因获得（2）目的基因与载体重组 （3）转入受体细胞并表达

16. 三、基因工程步骤 （一）目的基因获得 1、目的基因的分离 从细胞和组织中分离DNA。 （1）利用噬菌体或质粒摄取基因——单拷贝基因 噬菌体λ和φ80分别感染大肠杆菌，分别在LacZ两侧插入整合→UV照射，不准确脱离，λ和φ80可能带有LacZ基因，即λLac和φ80Lac，但Lac区段方向相反有互补关系→变性处理，离心取出λLac和φ80Lac各自H链混合→在Lac区段两H链互补成双链，两侧不能互补的成单链LacZ用核酸外切酶切去得Lac。

17. （2）鸟枪射击法——多拷贝基因 用限制性内切酶或超声波处理→各种大小DNA片段→凝胶电泳分开各DNA片段→分层切出各段，放入不同试管中搅碎，并加入少量缓冲液→提取DNA与载体结合→重组DNA分别感染大肠杆菌，使目的基因增殖→选择确定目的基因。 2、目的基因的合成 （1）化学合成法 根据目的基因基因核苷酸序列设计合成若干单链DNA片段，有一定互补性→片段混合，互补配对→在连接酶作用下连接。 第一用基因工程生产激素的基因——生长素释放抑制因子基因（人脑激素结构基因）用此法合成的（1977年）。

18. （2）酶促合成法 取出目的基因的mRNA→体外mRNA为模版在反向转录酶作用下反向转录CDNA→在DNA聚合酶作用下合成双链DNA（目的基因）。 1972年以来用此法合成人、鼠、鸡、鸭、鸽子等血红蛋白基因。 根据已知的基因或氨基酸序列，将化学合成寡核苷酸的方法与酶促合成DNA的方法结合起来可很快地人工合成基因。 如SOE-PCR技术可扩增出完整的基因序列。 SOE (交错延伸拼接) ——基因拼接的新方法 PCR(多聚酶链式反应)——扩增基因

19. 1. 化学合成的寡聚核苷酸(80-100个核苷酸)通过SOE将单链部分补齐； 2. PCR扩增DNA片段； 3. DNA变性； 4. 两个单链部分经SOE补齐双链； 5. PCR扩增DNA，利用多级SOE-PCR 扩增出完整的基因。 人工合成基因：

20. （二）载体与目的基因重组 1、载体（本质是DNA） 将“目的”基因导入受体细胞的运载工具。DNA片段与适合的载体DNA连接构成重组DNA →在载体DNA的运载下，高效率地进入宿主细胞，并在其中进行复制。 （1）载体的条件 a、具有复制原点，能自我复制，分子大小适中； b、具多克隆位点即有多种限制酶的切点，每种酶仅有1个切点； c、能自由从一个细胞进入另一细胞，并在受体细胞中高效复制增殖； d、目的基因插入后不影响载体活性； e、选择时的遗传标记，如抗生素基因。

21. （2）载体类型 ①细菌质粒：质粒是细菌细胞内独立于细菌染色体而自然存在的、能自我复制、易分离和导入的环状双链DNA分子。质粒具有重组表型检测标记，检测是否携带外源DNA片段。 根据在细胞内的复制程度： 严紧型：一个细菌细胞内的质粒数量有1-2个； 松驰型：每个细胞内有的20-60个。 如F质粒；PSC101带抗四环素标记基因；ColE1，带大肠杆菌素基因

22. Ti质粒 农杆菌中质粒 Ti质粒一部分DNA叫转移DNA(transfer DNA，T-DNA)，当农杆菌感染植物时，T-DNA便转移到植物的染色体上，诱导冠瘿瘤，并能合成冠瘿碱(opine)，作为农杆菌的碳源和氮源。 农杆菌感染产生冠缨瘤

23. 如pUC18质粒具有以下特点： ①. 分子量小，可接受较大外源片段； ②. 拷贝数多，每个细胞中有500个； ③. 克隆位点的酶切位点多，克隆方便； ④. 具有a－互补的显色表型，用于检测重组质粒的选择标记。

24. ②病毒 λ噬菌体(温和型)：基因组全长49kb。噬菌体DNA中间约2/3的序列为中间基因簇，位于两端的为DNA左、右臂。中间基因簇可被外源DNA替代而不影响浸染细菌的能力。能接受15-23kb外源DNA片段，可以作为cDNA或核DNA克隆的载体。 优点（1）携带大片段外源DNA分子，可占用总量的25%时仍不失活。 （2）不易引起生物危害，有助于“目的”基因进入细胞并增殖； SV40（寄生动物细胞）； ③ 改造的载体 ColE1改造成PBR322（抗氨苄青霉素和四环素）；PSC1340由ColE1和PSC101改造

25. 细菌细胞中存在限制修饰系统： 限制：降解外源DNA，防御异源遗传信息进入的手段。 修饰：修饰外源DNA片段后，保留在新细胞中。 2．工具酶 （1） 限制性内切酶(restriction enzyme)： 一种水解DNA的磷酸二脂酶，遗传工程中重要工具。 这种酶能识别双链DNA分子中一段特异的核苷酸序列，在这一段序列内将双链DNA分子切断。

26. 限制性内切酶的命名 根据其来自的生物名称，用英文字母和数字表示； ①. EcoRI来自大肠杆菌（Escherichia coli）； 　 ②. HindⅢ来自嗜血杆菌（Haemophilus influenzae ） 限制性内切酶的类别 第Ⅰ类酶（切割部位无特异性）： 　　如EcoB(大肠杆菌B株)、EcoK(大肠杆菌K株)分子量较大(约300000)，作用时需ATP、Mg++等辅助因子。 　　第Ⅱ类酶（切割部位有特异性）： 　　如EcoRI(大肠杆菌)、HindⅢ(嗜血杆菌)，分子量较小(20000~100000)，作用时需Mg++存在。

28. 特点： ①具有强的专一性，能识别双链DNA上特异的核苷酸序列，一般4－6个碱基对（回文结构， E.ColRⅠ识别GAATTC/CTTAAG）； ②在识别序列一定位置切断DNA（G与A之间解开二脂键）； ③产生两种末端（粘性和平齐末端）。

29. 平齐末端 如Sma Ⅰ：

30. 粘性末端 识别特定碱基顺序，为回文对称序列,又称反向重复序列： 从两个方向阅读而序列相同的序列。 如EcoRⅠ：

31. （2）连接酶 形成二脂键，1976年在T4中发现，现分离400多种，常用10多种，平齐末端必须用T4连接酶。 2、载体与目的基因重组 将目的基因与载体重组，用同一种限制酶切目的基因和载体→混合加入连接酶→重组DNA。

32. (1) 通过限制性内切酶的切割 和DNA连接酶的连接； (2)目标DNA分子 + 载体DNA，共价连接； (3)获得重组DNA分子。

33. （三）转移、筛选和表达 重组DNA分子引入宿主受体细胞→ 复制→ 建立无性繁殖系(clone)→ 并使外源基因在受体细胞中正常表达，翻译成蛋白质等基因产物、回收；或筛选出获得定向性状变异的个体。 1、转入受体细胞 细菌转化；转导；微型注射器登方法。 2、目的基因筛选 利用标记基因，如限制性内切酶用BamHI(液化淀粉芽孢杆菌中得到)，载体用PBR322（抗氨苄青霉素Apr和四环素Tcr）酶切点在Tcr基因内，Tcr→Tcs，目的基因插入Tcr基因内，即含目的基因的重组DNA为AprTcs，通过不同培养基筛选。

34. 3、目的基因表达 目的基因表达，是否有合适的启动子，用外来基因的启动子；启动子与受体细胞的RNA聚合酶是否协调；外源DNA插入方向与转录方向是否一致。 第三节 遗传工程成果及应用 一、理论研究中应用 基因文库、测序、基因功能研究等 二、生产上应用

35. 目前，基因工程研究发展迅速，已取得一系列重大突破。目前，基因工程研究发展迅速，已取得一系列重大突破。 基因工程技术已广泛用于工业、农业、畜牧业、医学、 法学等领域，为人类创造了巨大的财富。 具有生长激素的转基因鼠

36. 一、 基因工程工业 最早应用基因工程生产人的蛋白质的方法是在细菌中表达人的胰岛素(1982)。 胰岛素是一种控制糖代谢的蛋白质激素。缺乏糖尿病，注射胰岛素。 现已在细菌中生产10多种 药品，例如表皮生长因子、人生长激素因子、干扰素、乙型肝炎工程疫苗等。 　　目前，酵母菌、植物悬浮细胞、植株和动物培养细胞均成功地应用于表达外源蛋白。

37. 抗虫稻 对照 二、植物基因工程： 植物基因转化是指将外源基因转移到植物细胞内、并整合到植物基因组中稳定遗传和表达的过程，获得外源DNA的植物——转基因植物。 许多植物基因已经被分离、克隆。植物基因转化技术也得到不断发展和完善。

38. 1996年全世界转基因植物种植面积为170万公顷，1997年为1100万公顷，1998年为2780万公顷，1999年达到3990万公顷，2000年达到4420万公顷，2001年达到5260万公顷，2002年达到5000万公顷。2006年1.02亿公顷（科学时报，国际服务组织（ISAAA）发布2006年度报告）。1996年全世界转基因植物种植面积为170万公顷，1997年为1100万公顷，1998年为2780万公顷，1999年达到3990万公顷，2000年达到4420万公顷，2001年达到5260万公顷，2002年达到5000万公顷。2006年1.02亿公顷（科学时报，国际服务组织（ISAAA）发布2006年度报告）。

39. 2001年种植面积已超过100万公顷的作物有： 主要分布在美国（3570万hm2）、阿根廷（1180万hm2）、加拿大（320万hm2）和中国（150万hm2）等国。 大豆（3330万hm2，占全世界转基因作物的63%，均为抗除草剂大豆）、玉米（980万hm2 ，占19% ）、棉花（680万hm2 ，占13% ）、油菜（270万hm2 ，5% ）； 其它还有水稻、小麦、花生、向日葵、亚麻、甘蓝、马铃薯等，番茄、烟草、南瓜和木瓜等50多种转基因作物已实现商品化。

40. 2001年全世界转基因作物占相应种植总面积的百分率2001年全世界转基因作物占相应种植总面积的百分率

41. 2001年我国的转基因农作物和林木已达22种，其中 转基因棉花、大豆、马铃薯、烟草、玉米、花生、菠菜、 甜椒、小麦等进行了田间试验，转基因棉花已经大规模 商品化生产。 转基因棉花

42. 如：利用转基因羊，大量表达人类的抗胰蛋白酶。如：利用转基因羊，大量表达人类的抗胰蛋白酶。 可分泌人类生长因子Ⅸ的转基因羊“Polly”(下图)。 (Wilmut等，Nature 385, 1997) 三、转基因动物: 与转基因植物相比，转基因动物的发展要慢些。 转基因动物：目的基因+载体重组DNA微量注射法 将重组DNA导入受体合子细胞核中遗传转化。 克隆动物、转基因动物区别

43. 转基因牛：受精卵注射法

44. 转移有人类生长激素转基因鼠 人类生长激素转基因猪 同胞鼠对照

45. 四、 遗传疾病诊断 利用重组DNA技术进行遗传疾病诊断，是直接从DNA即基因水平进行诊断准确度高，速度快。

46. BamH I酶切位点 • 例如 RFLP （限制性片段长度多态性）法 ： 　①. 原理：限制性内切酶能识别并切割特异核苷酸序列。 　某位点核苷酸序列发生突变→有可能导致缺失或产生新的限制性酶切位点。 • 若突变只发生在同源染色体的一条 上，另一条正常，限制性内切酶酶切→ DNA片段带型可用于鉴别同源染色体的差异。 • 酶切后产生的DNA片段长度的差异， 称为限制性片段长度多态性　(restrictionfragmentlength polymorphisms，RFLP)。RFLP差异具有共显性特点。

47. ②. 镰刀性贫血病的诊断： • 　该病由β－球蛋白基因一个核苷酸突变（由GAG变成GTG)导致的，这个核苷酸改变也正好导致一个限制性酶切位点改变。 • 杂合体经酶切产生带型差异，识别该位点。

49. 五、基因治疗 利用基因工程技术，将特异基因导入并整合到有遗传缺陷患者的基因组中治疗遗传疾病，通常叫做基因治疗(gene therapy)。 单基因遗传病：白化病、先天性聋哑、血友病等。 多基因遗传病：唇裂、腭裂、精神分裂症、 先天性心脏病 方法：利用减毒的病毒DNA作载体(retro virus DNA)构建重组DNA分子用病毒包装物包装后形成的减毒病毒感染患者的细胞将正常基因整合到染色体上。

50. 例如，用漠洛尼氏鼠白血病病毒(MLV)改造而成的retro virus载体，已用于治疗严重综合免疫缺陷(SCID)。 SCID是由于腺苷脱氢酶基因(adenosine deaminase，ADA)突变引起的，患者无任何免疫功能。 方法：将ADA基因导入到MLV retrovirus 载体中取代该病毒DNA中的三个基因结构(gag、pol、env)将重组后的病毒去感染T细胞，使ADA基因整合到T细胞的染色体中实现基因治疗的目的。 2000年法国Fischer用该方法治愈患有SCID遗传病的两个婴儿(8个月和11个月) 。这一工作被认为是20世纪人类基因治疗上的重大突破。