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PROTOCOLOS

PROTOCOLOS. MCP 13 - Citogenética. Cláudio C. Silva, M.Sc. NPReplicon. Aspectos Básicos da Citogenética. Classificação de Denver, 1960. Meta : 1, 3, 19 e 20 Submeta : 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 16, 17, 18 e X Acro : 13, 14, 15, 21, 22 e Y. Grandes : 1, 2, 3, 4 e 5

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Presentation Transcript

  1. PROTOCOLOS MCP 13 - Citogenética Cláudio C. Silva, M.Sc. NPReplicon

  2. Aspectos Básicos da Citogenética Classificação de Denver, 1960 Meta: 1, 3, 19 e 20 Submeta: 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 16, 17, 18 e X Acro: 13, 14, 15, 21, 22 e Y Grandes: 1, 2, 3, 4 e 5 Médios: 6, X, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 e 18 Pequenos: 19, 20, 21, 22 e Y Cláudio C. Silva Depto de Biologia

  3. Aspectos Básicos da Citogenética • Método Cultura Celular para animais: • - Sangue periférico • - Fibroblastos • - Tumores sólidos, etc. • Sangue periférico Heparinizado.....................1,0mL • Meio RPMI.....................................................4,0mL • Glutamina........................................................0,1mL • Soro Fetal Bovino...........................................1,0mL • Fitohemaglutinina...........................................0,1mL • - Incubar na estufa 37oC; • Acrescentar 0,1mL de colchicina com 47h de cultivo; • Ao completar 48h fazer a colheita; Cláudio C. Silva Depto de Biologia

  4. Aspectos Básicos da Citogenética • Solução Hipotônica – KCl 0,075M • KCl .....................................................0,056g • Água destilada qsp.............................10,000mL • Obs. Armazenar em 37ºC até o momento de uso. • Solução Fixadora de Carnoy • Metanol ..................................... 30mL • Ácido Acético............................ 10mL • Obs. Armazenar em 4ºC até o momento de uso. Preparo das Soluções Cláudio C. Silva Depto de Biologia

  5. Aspectos Básicos da Citogenética • Quando completar 48h de cultivo, transferir a amostra para um cubo cônico de centrífuga; • Centrifugar a 1.000rpm por 10 minutos e desprezar o sobrenadante; • Acrescentar por gotejamento e agitação 10mL de solução hipotônica previamente aquecida de KCl a 0,075M; • Colocar na estufa a 37oC por 20 minutos, centrifugar a 1.000rpm por 10 minutos e desprezar o sobrenadante; • Acrescentar por gotejamento e agitação 10mL de fixador de Carnoy´s gelado; • Aguardar 10 minutos, centrifugar a 1.000rpm por 10 minutos e desprezar o sobrenadante; • Repetir os dois últimos passos por mais duas vezes; • Gotejar em uma lâmina limpa e desengordurada ± 3 gotas da amostra sob banho maria a 60oC e aguardar 30 segundos. Cláudio C. Silva Depto de Biologia

  6. Aspectos Básicos da Citogenética • Coloração e Análise das lâminas • Corar a lâmina teste utilizando o Panóptico; • Secar e observar em pequeno aumento para localizar as metáfases e depois em 1000X para a análise microscópica dos cromossomos; Cláudio C. Silva Depto de Biologia

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