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Reações de Nitrosilação Marcelo G. de Oliveira Prof. Associado – Instituto de Química – UNICAMP

Reações de Nitrosilação Marcelo G. de Oliveira Prof. Associado – Instituto de Química – UNICAMP. (e de Nitrosação também). Células endoteliais. vasodilatação. Fat. mitogênicos. Fat. anticoagulantes. Hemácias. agregação. antiagregação. Fat. trombogênicos. Inib. crescimento. Células

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Reações de Nitrosilação Marcelo G. de Oliveira Prof. Associado – Instituto de Química – UNICAMP

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Presentation Transcript

  1. Reações de Nitrosilação Marcelo G. de Oliveira Prof. Associado – Instituto de Química – UNICAMP (e de Nitrosação também)

  2. Células endoteliais vasodilatação Fat. mitogênicos Fat. anticoagulantes Hemácias agregação antiagregação Fat.trombogênicos Inib. crescimento Células musculares lisas Vaso sanguíneo Vasoconstrição

  3. Vasodilatação produzida pelo NO endógeno Células musculares lisas Células endoteliais O2 + L-Arginina NO NO + L-Citrulina GC e-NOS GTP cGMP Ca Ca2+ + Ach Relaxamento 1987 - Ignarro et al. - Proc. Natl. Acad. Sci USA 84, 9265  EDRF = NO 1998 - Furchgot, Ignarro and Murad – Prêmio Nobel de Fisiologia e Medicina

  4. Funções bioquímicas do NO SISTEMA MUSCULAR Regula o tônus muscular Vasodilatação localizada SISTEMA CIRCULATÓRIO Vasodilatação de veias e artérias Controle da pressão sanguínea Liberação de O2 a partir da HbO2 Controle do fluxo sanguíneo nos rins NO SISTEMA IMUNOLÓGICO Agente bactericida Inibe a replicação de vírus Destoi células tumorais SISTEMA NERVOSO Neurotransmissor Inibição da contração da musculatura lisa Plasticidade neuronal Memória de longo prazo SISTEMA DIGESTIVO Promove a dilatação estomacal Ativa os movimentos peristálticos

  5. s * z p * z y 2 p 2 p b s z b p x y 2 s Oxido Nítrico N a t o m i c o r b i t a l O a t o m i c o r b i t a l s * s 2 s b s s Diagrama de Orbitais Moleculares do NO

  6. Scientists discover a reason to lick your wounds By: Steven Hunt, June 18, 1997 By: Steven Hunt, June 18, 1997You've just cut your finger on the edge of a piece of paper. In a flash, you stick your finger in your mouth, thinking that will make it better. Well…your hunch is not that far off. In fact, licking your wounds is one of those instinctive things most people don't think about much, but according to researchers in Britain, it's not only instinctive. It has healing properties to boot.In the same way that dogs and other animals are often seen licking their wounds, humans too, it's been found, can do better by licking their injuries than by leaving them alone. Dr. Nigel Benjamin, a clinical pharmacologist with St. Bartholomew's and the London School of Medicine and Dentistry, has discovered that it all comes down to how saliva reacts with skin."We'd been looking at nitrite in saliva for some time," Benjamin states, "mainly because we'd been interested in nitric oxide and its effects in disease processes." That's because nitric oxide - the compound that results when saliva interacts with the skin - has for several years been known to play a role in the body's fight against germs. But Benjamin and his London colleagues were interested in finding out whether licking your wounds had any real effect on the healing process."We looked at the comparison of what happens when you use saliva to wet your skin compared to just normal saline," Benjamin explains. "And we found that the saliva produces loads of nitric oxide." With nearly 10 times the amount of nitric oxide on licked skin compared to non-licked skin, Benjamin says, "there is a definite function for this nitric oxide in order to protect us when we wound ourselves from contamination by unwanted bacteria."

  7. Ações do NO no Sistema Imunológico Neutrófilos Macrófagos 2NO + O2 = 2NO2 = N2O3 N2O3+H2O = 2HNO2= 2NO2-- + 2 H+ NO3- NOem excesso  choque séptico

  8. AÇÃO CITOTÓXICA DO NO CONTRA BACTÉRIAS VÍRUS E CÉLULAS TUMORAIS NO • Reação com: • Centros Fe-S(Fe4S4) • - RSH • - R-tirosila Desaminação do DNA Oxidação de membranas • Inativação de enzimas: • do ciclo de Krebs • da síntese de DNA • de funções mitocondriais APOPTOSE NECROSE

  9. Fe - NO (NITROSILAÇÃO) NO + Fe(II) ou Fe(III) NO = ligante nitrosila CO = ligante carbonila O2/Cu2+/O2.- R-SNO NO + R-SH (NITROSAÇÃO) O2/Cu2+/O2.- R-NNO NO + R-NH2 -SNO = NITROSOTIOL -NNO = NITROSAMINA

  10. NO, Superóxido e Peroxinitrito NO O2.- Oh NO !! NO + O2.- ONOO- ONOO- + H+ NO2. + OH. ONOO- em excesso  choque séptico

  11. Ativação da Guanilato Ciclase solúvel: Uma reação de NITROSILAÇÃO

  12. Hipertensão DISFUNÇÃO ENDOTELIAL Oclusão arterial Vasoespasmo ATEROSCLEROSE Falha na regulação da produção endógena de Óxido Nítrico (NO)

  13. Doadores exógenos de NO Células musculares lisas Células Endoteliais Relaxamento NO GTP cGMP NO GC Nitratos de Isosorbida [Fe(CN)5NO]2- GC GTP cGMP NO Relaxamento

  14. Nitroprussiato de sódio Shishido, SM, de Oliveira MG, Prog. React. Kinetic Mech.26, 239, 2001

  15. e- + II

  16. 72 68 % Transmitância 64 60 CN NPS red 2089 56 52 CN NPS -1 1850 2150 2100 2050 2000 1950 1900 2200 -1 Número de onda / cm NPS + cisteina (pH 7.4) Variação espectral no IV NO NPS red [FeII(CN)5H2O]3- 2038 NO NPS

  17. [FeII(CN)5H2O]3- + NO + 1/2 RSSR (Aquoferrocianeto) 2038 cm-1 [FeII(CN)5NO+]2- + RS- [FeI (CN)5NO+]3- + 1/2 RSSR (NPS reduzido) 2089 cm-1

  18. 0,3 Absorbância 0,2 0,1 400 500 600 700 800 300 Comprimento de onda / nm NPS + cisteina (pH 10) Variação espectral (UV/VIS) [FeII(CN)5H2O]3- 338 Espécie transiente 521

  19. ADUTO INTERMEDIÁRIO NO ATAQUE NUCLEOFÍLICO DO ÂNION TIOLATO AO NO DO NPS

  20. MODELO ANIMAL RATOS WISTAR: - Normotensos - Agudamente hipertensos (L-NAME) Pressão arterial Média (MAP) (Artéria femural) Infusões intravenosas de: NPS NAC +

  21. Normotensos hipertensos QUEDA DA PRESSÃO ARTERIAL MÉDIA (MAP) APÓS A INFUSÃO DE NPS e (NPS + NAC) Ricardo, KF, Shishido SM, de Oliveira, MG, Krieger, MH,Nitric Oxide Biology and Chemistry: 7, 57, 2002

  22. NO H2O -S- H+ -S• ------------

  23. S-NITROSOTIOIS (RSNOs) 181 Å3 S-nitroso-L-cisteina

  24. Sintetizando S-nitrosotiois NOgás Solução de tiól N ÃO ACONTECE NADA!!!

  25. s * z p * z y 2 p 2 p b s z b p x y 2 s Oxido Nítrico NO+ RSH  RSNO + H+ + e- N a t o m i c o r b i t a l O a t o m i c o r b i t a l s * s 2 s b s s Diagrama de Orbitais Moleculares do NO

  26. S-NITROSAÇÃO DE TIOIS O2N-NO O2N- NO+ O2N- NO+ + RS- H+RS-NO + H+NO2- 2 NO + O2 2 NO2 N2O4 NO N2O3

  27. S-NITROSAÇÃO DE TIOIS EM SOLUÇÃO AQUOSA N2O3 + H2O2 HNO2 2 HO- ••• N O+ 2H+ + 2NO2- HO-••• NO+ + RS-•••H+  RS-NO + H2O 4NO + O2 + 4 RSH 4RSNO + 2 H2O

  28. Sistema de nitrosação PATENTE REQUERIDA (INPI, 2001)

  29. S-nitrosotiois: Transições eletrônicas nN* (Anti) * nN* (Syn)

  30. 2.5 1.0 2.0 Abs. em =545 nm 0.5 1.5 0.0 0 50 100 Absorbância Tempo/ s 1.0 0.5 0.0 300 400 500 600 Comprimento de onda / nm Controle da síntese de S-nitrosotiois por borbulhamento

  31. Estruturas dos S-nitrosotiois sintetizados S-nitrosoglutationa (GSNO) S-nitroso-N-acetilcisteina (SNAC) S-nitrosocisteina (CisNO)

  32. Dose-resposta da PAM na administração de SNAC em ratos AGUDAMENTE HIPERTENSOS (L-NAME) NORMOTENSOS

  33. Potência Azul de Met. Duração do efeito POTÊNCIA E DURAÇÃO DO EFEITO HIPOTENSOR DA SNAC E DO NPS EM RATOS WISTAR NORMOTENSOS Ricardo, K F, Shishido SM, de Oliveira, MG, Krieger, MH,Nitric Oxide Biol.and Chem. 7, 57 (2002)

  34. NO RS-NO R-S H SNO S- H+ S Proteína

  35. MODELO ANIMAL Efeito da administração de GSNO na nitrosação do receptor de insulina (Modelo de Resistência à Insulina) Ratos Wistar - Diabéticos (ob/ob) - Nocaute iNOS (C57BL/6) (controle + Dieta hipercolesterolêmica –24 semanas)

  36. DIABETES TIPO 2 RESISTÊNCIA À iNSULINA DISLIPIDEMIA HIPERTENSÃO ATEROSCLEROSE AUMENTO NA PRODUÇÃO DE iNOs

  37. Ligação da Insulina ao Receptor de insulina trans-membrana Insulina Receptor de insulina Membrana plasmática

  38. Autofosforilação dos resíduos de tirosina do receptor de Insulina Membrana plasmática

  39. Cadeia A da Insulina Cadeia B da Insulina

  40. Monômero da Insulina

  41. S S Nitrosação da subunidade  do Receptor de Insulina RS-NO RS-H -RSH -RS-NO

  42. Detecção da nitrosação do receptor de insulina pelo Método fluorimétrico DAN/NAT HNO2 30 min, 37C pH 1-2 H+ pH 11-12 excit= 375 nm 2,3 naftotriazol (NAT) 2 (Receptor - S-NO) (Receptor- S – S - Receptor) + 2 NO 2 NO + O2 2 NO2-+ H2O2 HNO2 HgCl2

  43. Espectro de emissão do Naftotriazol e curva de calibração com NO2- Limite de detecção: < 5 nmol L-1

  44. Detecção da nitrosação dos substratos de receptores de Insulina (IRS1) em imunoprecipitados (ratos ob/ob) Carvalho-Filho, M.A., Ueno, M., Seabra, A.B., Carvalheira, B.C., de Oliveira, M.G., Veloso, L.ª, Curi, R., Saad, M.J.ª, J. Biol Chem. 2004 - Submetido

  45. Efeitos da GSNO na: atividade da tirosina-quinase, captação de glicose e síntese de glicogênio

  46. COLABORAÇÕES IB/UNICAMP FCM/UNICAMP Profa. Marta H. Krieger Prof. Mário Saad FM/USP INCOR/USP Profa. Claudia P.M.S de Oliveira Prof. Francisco R.M. Laurindo UNIV. EDINBURGO ICB/USP Profa. Sílvia R.B.Uliana Prof. Richard Weller

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