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实验三

实验三. 实验内容 1. 溶血空斑试验（ PFC 测定） 2. 酶联免疫吸附试验（ ELISA ）（示教） 3. 淋转（标本片）. 溶血空斑试验（ PFC 测定）. 实验目的： 1. 掌握 PFC 试验的基本原理及实验 方法； 2. 了解 PFC 试验的临床 意义。. 实验原理. 溶血空斑试验(Hemolytic plaque technique，Plaque—forming cell assay)是检测和计数抗体形成细胞的一种常用方法。

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实验三

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Presentation Transcript

  1. 实验三 • 实验内容 1.溶血空斑试验（PFC测定） 2.酶联免疫吸附试验（ELISA）（示教） 3.淋转（标本片）

  2. 溶血空斑试验（PFC测定） • 实验目的： 1.掌握PFC试验的基本原理及实验方法； 2. 了解PFC试验的临床意义。

  3. 实验原理 • 溶血空斑试验(Hemolytic plaquetechnique，Plaque—forming cell assay)是检测和计数抗体形成细胞的一种常用方法。 • 原理是将绵羊红细胞(SRBC)免疫过的小鼠脾细胞制成的细胞悬液，与一定量的绵羊红细胞混合，在补体的参与下，使抗体产生细胞周围SRBC溶解，形成一个肉眼可见的空斑或溶血现象。 • 主要用于检测B细胞的抗体生成能力。

  4. 实验材料 • 1.小鼠18～22g。 • 2.5％、15％SRBC。 • 3.新鲜的豚鼠血清(补体)。 • 4.Hank's液。 • 5.解剖器械（剪刀、镊子）、解剖板。 • 6.无菌空平皿、15目钢网、组织研磨器、注射器、吸管、毛细滴管、试管、微量加样器。 • 7.玻片小室、酒精灯、石蜡、石蜡锅等。

  5. 5％ SRBC免疫小鼠腹腔内注射1.0ml 4d 颈椎脱臼处死小鼠，取脾脏，用Hank’s液漂洗，在无菌平皿中剪碎，200目钢网制成脾细胞悬液 实 验 流 程 洗涤：1000r/min×10min 去上清，加Hank’s液制成1×107／m1脾细胞悬液 100μl 脾细胞悬液 15％SRBC 200μl 200μl 补体 1mlHank’s液 混匀，灌注小室，37℃放置l小时，观察结果

  6. 实验方法 1．免疫小鼠：5％SRBC lml无菌操作注射于小鼠腹腔。 2． 脾细胞悬液制备：四天后颈椎脱臼处死小鼠，取脾 脏，去脂肪和筋膜，用Hank’s液漂洗，在无菌平皿中剪 碎，用组织研磨器在200目钢网内研磨制成脾细胞悬液。 3.洗涤：取研磨液1ml放于小试管中，加满Hank’s液，混 匀、离心1000rpm10min。 4.弃去上清，加Hank’s液使沉淀的脾细胞恢复1ml体积。 5.混合：取脾细胞 100 微升 15%SRBC 200微升 　　 　补体 200微升 Hank’s液 1毫升 6.灌注小室：混匀后，用尖吸管灌小室，封蜡、标记，放37℃温箱37℃保温30～60min，观察结果

  7. 结果： 　　计数空斑总数，并换算出每百万脾细胞中所含抗体形成细胞数。如用于筛选药物，可比较给药组和对照组每1×106个脾细胞中抗体形成细胞（即溶血空斑）数的平均值，以表示并比较药物对机体产生抗体能力的影响程度。 • 右图显示一个 B 细胞位于空斑中央。  

  8. 【注意事项】  1. 一般选用纯系小鼠。  2.在加入细胞之前，琼脂平板制备时要使琼脂完全溶解，加入脾细胞时应检查是否充分均匀分布，因一时性的冷激会导致形成小的凝胶灶，造成观察和判断困难。  3.注意防止琼脂泡沫的出现。  4 ．摘除的脾不宜立即放入冰浴中的液体中，可显著降低空斑计数。 

  9. 酶联免疫吸附试验（ELISA）－双位点法检测麻疹病毒IgG抗体（示教）酶联免疫吸附试验（ELISA）－双位点法检测麻疹病毒IgG抗体（示教）

  10. 实验目的 • 1.掌握酶联免疫吸附试验--双位点法检测麻疹病毒IgG抗体的原理. • 2．学习酶联免疫吸附试验--双位点法检测麻疹病毒IgG抗体的实验方法。

  11. 实验原理 • 酶联免疫吸附实验（ELISA），是目前应用最广泛的免疫酶标记技术包括双抗体夹心法和间接法。 • 本试验采用麻疹单克隆抗体包被，然后用纯化麻疹抗原结合制成预包被板条，测定人血清中麻疹IgG抗体。IgG抗体测定用于人群抗体水平调查和疫苗效果观察，应进行血清IgG抗体的滴度测定(1：100)，对阴性反应者应进行疫苗加强免疫，提高其抗麻疹的免疫水平。

  12. 实验材料 • 1．待测血清 • 2．试剂盒；包括抗原包被板(或板条)、阴性对照血清、阳性对照血清、样本稀释液、酶结合物、显色剂A、显色剂B、终止液、洗涤液(30×0．01MPBS)。 　 • 3．毛细管、刻度吸管、小试管等。

  13. 实验方法 1．采血2ml，离心2000rpm 10min 2．样本稀释：取血清用生理盐水稀释1：10， 1：100 3．加样：每孔加2滴样本稀释液，再分别加1：10 1：100 的稀释血清，同时加阳性和阴性对照血清于各自孔中，留一孔作空白对照，放置37℃温箱45min。甩干后用洗涤液洗孔4 次，每次静置片刻，然后在吸水纸上轻轻拍干。 4．加酶（ Ab2 ）：摇匀每孔加 2 滴酶结合物，空白孔不加， 37 温箱 30min，洗板同上。

  14. 5．显色：每孔先加1滴显色剂A，然后加1滴显色剂B（包括空白孔），37℃温箱10min。每孔加1滴终止液终止反应。肉眼判定不终止。5．显色：每孔先加1滴显色剂A，然后加1滴显色剂B（包括空白孔），37℃温箱10min。每孔加1滴终止液终止反应。肉眼判定不终止。 结果： 1、目测法：与阳性和阴性对照比较，观察颜色深浅作出判断 2、测吸光值（A值）：用酶标检测仪测定各孔A值

  15. 淋转（标本片）

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