荧光及荧光分析

1. 温州大学 现代物理化学技术 荧光及荧光分析 陈 伟 wchen@wzu.edu.cn 微纳结构材料 & 物理化学研究所

2. 荧光及荧光分析 • 概述 • 基本原理 • 荧光分析 • 仪器与技术 • 应用与示例 微纳结构材料 & 物理化学研究所

3. 光学光谱区 50 m ~300 m 200nm ~380nm 10nm~200nm 380nm ~ 780nm 780 nm ~ 2.5 m 2.5 m ~ 50 m 微纳结构材料 & 物理化学研究所

4. 荧光基础理论 • 什么是荧光 ？ 当紫外或可见光照射到某些物质上时，这 些物质就会发射出波长和强度各不相同的 光线，停止照射光照射时，这种光线马上 或逐渐消失，这就是荧光。 微纳结构材料 & 物理化学研究所

5. 荧光的发现及发展 • 1575年，西班牙医生N. Monardes首先发现荧光 • 1852年，Stokes发现荧光波长比照射光波长 要长，认定荧光是发射光。 • 1867年，首次用于分析测定。 • 1952年，商品荧光分光光度计出现。 • 2008年，日本村修、美国马丁·沙尔菲、美籍 华裔钱永健因发现并发展了绿色荧光蛋白质技 术而获诺贝尔化学奖。 微纳结构材料 & 物理化学研究所

6. 单重态和三重态 电子激发态的多重度：M=2S+1 S为电子自旋量子数的代数和(0或1)； 单重态：全部轨道里的电子都是自旋配对的，S=0,M=1； 三重态：分子具有自旋不配对的电子，S=1,M=3. 平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应单重态能级低； 大多数有机分子的基态处于单重态； 微纳结构材料 & 物理化学研究所

7. 基态单重态 激发单重态 激发三重态 电子跃迁类型 允许跃迁 禁阻跃迁 S0 S1, S2, S3…… T1, T2, T3…… 区别：电子自旋方向不同，激发三重态的能级稍低一些。 微纳结构材料 & 物理化学研究所

8. 电子跃迁类型 在单重激发态中，两个电子平行自旋，单重态分子具有抗磁性，其激发态的平均寿命大约为10-8s，而三重态分子具有顺磁性，其激发态的平均寿命为10-4 ~ 1s以上（通常用S和T分别表示单重态和三重态）。 激发态与基态中的电子自旋方向相反，称为激发单重态 （S）抗磁性 激发态与基态中的电子自旋方向相同，称为激发三重态 （T）顺磁性 区别：电子自旋方向不同，激发三重态的能级稍低一些。 微纳结构材料 & 物理化学研究所

9. 电子跃迁 • 处于激发态的电子，通常以辐射跃迁方式或无 辐射跃迁方式再回到基态。 • 辐射跃迁主要涉及到荧光、延迟荧光或磷光的发 射； • 无辐射跃迁则是指以热的形式辐射其多余的能 量，包括振动弛豫（VR）、内转移（IR）、外 转移（EC）及系间窜越（ISC）等，各种跃迁方 式发生的可能性及程度，与荧光物质本身的结构 及激发时的物理和化学环境等因素有关。 微纳结构材料 & 物理化学研究所

10. 振动弛豫 内转移 无辐射跃迁 外转移 体系间跨越 分子的去激发 荧光（F） 辐射跃迁 磷光（P） 分子的去激发 微纳结构材料 & 物理化学研究所

11. 辐射跃迁 荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最低振动能级回到基态所发出的辐射。寿命为10-8 ~ 10 -11s。由于是相同多重态之间的跃迁，几率较大，速度大，速率常数kf为106~109s-1。 磷光： 从第一激发三重态的最低振动能级回到基态所发出的辐射。由于磷光的产生伴随自旋多重态的改变，辐射速度远小于荧光，磷光寿命为10-4 ~10s。在光照停止后，仍可持续一段时间。 微纳结构材料 & 物理化学研究所

12. 无辐射跃迁 振动弛豫 它是指 在同一电子能级中，电子由高振动能级转至低振动能级，而将多余的能量以热的形式发出。发生振动弛豫的时间为10-12s数量级。 微纳结构材料 & 物理化学研究所

13. 内转换 当两个电子能级非常靠近以至其振动能级有重叠时，常发生电子由高能级以无辐射跃迁方式转移至低能级。 无辐射跃迁 微纳结构材料 & 物理化学研究所

14. 无辐射跃迁 外转移 指激发分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用及能量转移，使荧光或磷光强度减弱甚至消失。这一现象称为“熄灭”或“猝灭”。 荧光与磷光的根本区别： 荧光是由激发单重态最低振动能层至基态各振动能层间跃迁产生的；而磷光是由激发三重态的最低振动能层至基态各振动能层间跃迁产生的。 微纳结构材料 & 物理化学研究所

15. 系间窜越 指不同多重态间的无辐射跃迁， 例如S1→T1就是一种体系间跨跃。 通常，发生体系间跨跃时，电子 由S1的较低振动能级转移至T1的 较高振动能级处。有时，通过热 激发，有可能发生T1→S1，然后 由S1发生荧光。这是产生延迟荧光的机理。 改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行。 S1 T1 hvA hvF hvP S0 无辐射跃迁 微纳结构材料 & 物理化学研究所

16. 内转换 内转换 振动弛豫 S2 系间跨越 S1 T2 T1 能 量 发 射 荧 光 发 射 磷 光 外转换 吸 收 振动弛豫 S0 l3 l2 l 1 l 2 微纳结构材料 & 物理化学研究所

17. 光源 吸收池 单色器 It I0 狭缝 单色器 狭缝 检测器 荧光测量 荧光的检测 微纳结构材料 & 物理化学研究所

18. 激发光谱与发射光谱 任何荧（磷）光都具有两种特征光谱：激发光谱与发射光谱。它们是荧（磷）光定性分析的基础。 1）激发光谱 改变激发波长，测量在最强荧（磷）光发射波长处的强度变化，以激发波长对荧光强度作图可得到激发光谱。 微纳结构材料 & 物理化学研究所

19. 激发光谱与发射光谱 激发光谱形状与吸收光谱形状完全相似，经校正后二者完全相同！这是因为分子吸收光能的过程就是分子的激发过程。 激发光谱可用于鉴别荧光物质；在定量时，用于选择最适宜的激发波长。 微纳结构材料 & 物理化学研究所

20. 激发光谱与发射光谱 2）发射光谱 发射光谱即荧光光谱。一定波长和强度的激发波长辐照荧光物质，产生不同波长的强度的荧光，以荧光强度对其波长作图可得荧光发射光谱。 由于不同物质具不同的特征发射峰，因而使用荧光发射光谱可用于鉴别荧光物质。 微纳结构材料 & 物理化学研究所

21. 激发光谱与发射光谱 i）波长比较 与激发（或吸收）波长相比，荧光发射波长更长。 ii）形状比较 荧光光谱形状与激发波长无关。换句话说，不管激发波长如何，电子都是从第一电子激发态的最低振动能层跃迁到基态的各个振动能层。 微纳结构材料 & 物理化学研究所

22. 4 3 2 1 S1 S0 4 3 2 1 激发光谱与发射光谱的关系 iii）镜像对称 通常荧光光谱与吸收光谱呈镜像对称关系 微纳结构材料 & 物理化学研究所

23. =kf/(kf+∑K) 分子结构与荧光的关系 产生并可观察到荧光的条件： i）分子具有与辐射频率相应的荧光结构（内因）； ii）吸收特征频率的光后，应可产生具一定量子效率的荧光。 即量子效率 F足够大： 微纳结构材料 & 物理化学研究所

24. 分子结构与荧光 1）跃迁类型： 通常，具有—*及n—*跃迁结构的分子才会产生荧光。而且具—*跃迁的荧光效率比 n—*跃迁的要大得多。 2）共轭效应： 共轭度越大，荧光越强。 微纳结构材料 & 物理化学研究所

25. 共轭结构与荧光的关系 提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移。 微纳结构材料 & 物理化学研究所

26. 分子结构与荧光 3）刚性结构和共平面性： 分子刚性（Rigidity）越强，分子振动少， 与其它分子碰撞失活的机率下降，荧光量 子效率提高。 如荧光素（ 大）与酚酞（=0）； 微纳结构材料 & 物理化学研究所

27. 分子结构与荧光 微纳结构材料 & 物理化学研究所

28. 8 — 羟基喹啉镁 8 — 羟基喹啉 刚性结构和共平面性与荧光的关系 形成络合物后,形成刚性平面 微纳结构材料 & 物理化学研究所

29. 7 - 二甲胺萘 – 1 - 磺酸盐 F=0.75 8 - 二甲胺萘 – 1 - 磺酸盐 F=0.03 刚性结构和共平面性与荧光的关系 空间位阻与荧光的关系 微纳结构材料 & 物理化学研究所

30. 刚性结构和共平面性与荧光的关系 空间位阻与荧光的关系 1，2—二苯乙烯 反式结构，发光 顺式结构，不发光 微纳结构材料 & 物理化学研究所

31. 分子结构与荧光 4）取代基：  给电子取代基增强荧光（p-共轭），如 -OH、-OR、 -NH2、-NR2等；  吸电子基降低荧光，如 -COOH、 -C=O、 -NO2、-NO、-X等；  重原子降低荧光但增强磷光， 如苯环被卤素取代，从氟苯到碘苯，荧光逐渐减弱到消失，该现象也称重原子效应。 微纳结构材料 & 物理化学研究所

32. 取代基的影响 • 给电子取代基 增强荧光 —NH2, —NHR, —NR2, —OH, —OR, 等 EM 285-365 nm 270-310 nm 310-405 nm 相对荧光强度 1.8 1.0 2.0 微纳结构材料 & 物理化学研究所

33. 吸电子取代基 n 电子不与  电子共轭 羰基类 1）n* 跃迁禁阻，小，10-2 2）最低单重态为 n, * 型，易于ISC。荧光弱，磷光强 非荧光 强荧光 微纳结构材料 & 物理化学研究所

34. 取代基的位置 1） 有利于电子离域的，则荧光增强。 因此，一般邻位、对位给电子基团导致荧光增强。 2）有利于形成环，导致分子刚性增大，荧光增强。 荧光强度较强 荧光强度较弱 微纳结构材料 & 物理化学研究所

35. 重原子效应 重原子降低荧光但增强磷光如苯环被卤素取代，从氟苯到碘苯，荧光逐渐减弱到消失，该现象也称重原子效应。 F 0.22 10-5 P 0.14 0.43 P 1.9 s 0.024 s 微纳结构材料 & 物理化学研究所

36. 重原子效应 微纳结构材料 & 物理化学研究所

37. 最低单重态的性质 • , * 不含有杂原子（N,O,S）的有机化合物均属于这一类，其特点是自旋允许跃迁，大，104，荧光强 • n, * 1) 含有杂原子（N,O,S）的有机化合物多属于这一类，含有n 电子，其特点是自旋禁阻 ， 小，102, ISC速率大，荧光弱。 2) n 轨道的能量受环境的影响大，如质子化或生成氢键等，将使n 轨道的能量降低，导致n*跃迁的能量增大。荧光分子的最低激发态可能变成,*。 分为两类 含氮杂环有机物 含羰基杂原子有机物 微纳结构材料 & 物理化学研究所

38. 含氮杂环有机物 荧光随溶剂极性的增大而增强 例1 喹啉 介质 苯 乙醇 水 相对荧光 1 30 1000 可以理解为N上的孤对电子与水形成氢键，使n轨道能量降低，从而使最低单重激发态由n, *变成, *。 微纳结构材料 & 物理化学研究所

39. 含羰基有机物 芳香类 S1与T1能级间隙小， ISC效率高，接近于1。 脂肪类 有微弱的荧光，ISC效率低一些 微纳结构材料 & 物理化学研究所

40. 影响荧光的外界因素 （一）溶剂效应：  溶剂极性可增加或降低荧光强度 （改变—*及n—*跃迁的能量）；  与溶剂作用从而改变荧光物质结构来增加或降低荧光强度。 微纳结构材料 & 物理化学研究所

41. 影响荧光的外界因素 （二）温度： 温度增加，荧光强度下降（因为内、外转换增加、粘度或“刚性”降低）。因此体系降低温度可增加荧光分析灵敏度。 微纳结构材料 & 物理化学研究所

42. pH < 2 pH7~12 pH >13 影响荧光的外界因素 （三）pH值： 具酸或碱性基团的有机物质，在不同pH值时，其结构可能发生变化，因而荧光强度将发生改变；对无机荧光物质，因pH值会影响其稳定性，因而也可使其荧光强度发生改变。 微纳结构材料 & 物理化学研究所

43. 影响荧光的外界因素 （四）内滤光和自吸： 体系内存在可以吸收荧光的物质，或荧光物质的荧光短波长与激发光长波长有重叠，均可使荧光强度下降，称为内滤光；当荧光物质浓度较大时，可吸收自身的荧光发射称为荧光自吸。 微纳结构材料 & 物理化学研究所

44. 荧光猝灭 荧 光 猝（熄） 灭：荧光分子与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起荧光强度降低或消失的现象。 荧光猝（熄）灭剂：能引起荧光猝灭的物质称为荧光熄灭剂。 相对速率 1 K1 [M*] K2 [M*] [Q] （1）碰撞熄灭 激发 发射 熄灭 与分子的直径、粘度、温度等因素有关。 微纳结构材料 & 物理化学研究所

45. hv 荧光猝灭 （2） 能量转移熄灭 再吸收过程： 共振能量转移： 分子内能量转移： 微纳结构材料 & 物理化学研究所

46. 荧光猝灭 （3） 氧的熄灭作用 没有除氧，溶液中难以观察到磷光 氧分子是荧光、磷光的熄灭剂， 微纳结构材料 & 物理化学研究所

47. 荧光猝灭 （4） 自熄灭与自吸收 当荧光物质的浓度大于1g/L时，常发生荧光的自熄灭(浓度熄灭) 由于F < 1，使荧光强度减弱或消失. 自吸收： 形成二聚体： 由于二聚体不发荧光，或发射荧光的能量有改变，造成自熄灭现象。 微纳结构材料 & 物理化学研究所

48. 单色器 单色器 仪器结构示意图 光源 放大和指示仪表 I0 。 液 槽 I 检测器 荧光分光光度计的结构示意图 微纳结构材料 & 物理化学研究所

49. 仪器与技术 • 荧光计的主要部件 1）光源：氙灯、高压汞灯、激光； 2）样品池：石英（低荧光材料）； 3）两个单色器： 选择激发光单色器；分离荧光单色器； 4）检测器：光电倍增管。 微纳结构材料 & 物理化学研究所

50. 基本装置及主要构件 1、激发光源 （1）条件: ① 足够的强度 ② 紫外，可见区域有连续的光谱 ③ 强度与波长无关 ④ 光强稳定 （2）激发光源: ①氙灯（高压）: 250～1000nm光谱区呈连续光谱，使用寿命大约为2000h。 ②汞灯（高压）:在紫外区激发，365nm，使用寿命 1500～3000小时。 微纳结构材料 & 物理化学研究所