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Paarweises Sequenzalignment

Paarweises Sequenzalignment. Methoden des Sequenzalignments Áustauschmatrizen Bedeutsamkeit von Alignments BLAST, Algorithmus – Parameter – Ausgabe http://www.ncbi.nih.gov Diese Vorlesung lehnt sich eng an das BLAST Tutorial- Buch (links) an, Kapitel 3-9

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  1. Paarweises Sequenzalignment • Methoden des Sequenzalignments • Áustauschmatrizen • Bedeutsamkeit von Alignments • BLAST, Algorithmus – Parameter – Ausgabe http://www.ncbi.nih.gov • Diese Vorlesung lehnt sich eng an das BLAST Tutorial- • Buch (links) an, Kapitel 3-9 • siehe auch Vorlesung Bioinformatik I von Prof. Lenhof, • Wochen 3 und 5 Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  2. Sequenz-Alignment • Wenn man 2 oder mehr Sequenzen vorliegen hat, möchte man zunächst einmal • ihre Ähnlichkeiten quantitativ erfassen • Entsprechungen zwischen einzelnen Bausteinen beider Sequenzen erfassen • Gesetzmässigkeiten der Konservierung und Variabilität beobachten • Rückschlüsse auf entwicklungsgeschichtliche Verwandschaftsverhältnisse ziehen • Wichtiges Ziel: Annotation, z.B. Zuordnung von Struktur und Funktion Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  3. Suche in Datenbanken • Identifiziere Ähnlichkeiten zwischen • einer neuen Testsequenz, deren • Struktur und Funktion unbekannt und nicht charakterisiert ist • und Sequenzen in (öffentlichen) Datenbankenderen Strukturen und Funktionen bekannt sind. • N.B. Die ähnlichen Regionen können die ganze Sequenz, oder Teile von ihr umfassen! • Lokales Alignment  globales Alignment Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  4. Informationstheorie • Wenn ein Kind auf jede Frage “nein” antwortet, enthalten die Antworten praktisch keine Information. Wenn die Antworten “ja” oder “nein” sind, enthalten Sie mehr Information. • Definition der Information: • p ist die Wahrscheinlichkeit einer Antwort. • Logarithmitsierte Werte zur Basis 2 heissen bits, aus binary und digit. • Wenn die Wahrscheinlichkeit, daß ein Kind kein Eis mag 0.25 ist, hat die Antwort 2 bits an Information. Die gegenteilige Information (es mag Eis) hat nur • 0.41 bits an Information. • Bezüglich der Basis e, heisst die entsprechende Einheit nats. Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  5. Information Theory • Tossing a coin is a source of head and tail symbols. • A message might be: tththtt • The letters A C G T are emitted from a DNA source. If the probability of any particular symbol is simply 1/n the information of any symbol is log2(n). This value is also the average. • The formal name for the average information per symbol is entropy. • If the symbols are not equally probable one has to weigh the information of each symbol by its probability of occurring. • Shannon’s entropy: • A random DNA source has an entropy of: • { (0.25)(-2) + (0.25)(-2) + (0.25)(-2) + (0.25)(-2) } = 2 bits • A DNA source with 90 % A or T and 10% C or G has an entropy of: • - { 2 (0.45)(-1.15) + 2 (0.05)(-4.32) } = 1.47 bits Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  6. Amino Acid Similarity • Dayhoff represented the similarity (observed exchange frequences between related sequences) between amino acids as a log2 odds ratio, or lod score. • Lod score of an amino acid: take the log2 of the ratio of a pairing’s observed frequency divided by the pairing’s randomly expected frequency. • Lod score = 0 → observed and expected frequencies are equal • > 0 → a pair of letters is common • < 0 → unlikely pairing • General formula for the score sijof two amino acids i and j. With: individual properties pi and pj, pairing frequency qjj, Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  7. Ähnlichkeit der Aminosäuren • Beispiel: die relative Häufigkeit von Methionin und Leucin seien 0.01 und 0.1. • Durch zufällige Paarung erwartet man 1/1000 Austauschpaare Met – Leu. • Wenn die beobachtete Paarungshäufigkeit 1/500 ist, ist das Verhältnis der • Häufigkeiten 2/1. • Im Logarithmus zur Basis 2 ergibt sich ein lod score von +1 or 1 bit. • If the frequency of Arginine is 0.1 and its frequency of pairing with Leu is 1/500, • the lod score of an Arg – Leu pair is -2.322 bits. • Usually one uses nats, multiplies the values by a scaling factor and rounds them • to integer values → scoring matrices PAM and BLOSUM. • These integer values are called raw scores. Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  8. Towards Karlin-Altschul statistical theory • Raw scores can be misleading because scaling factors are arbitrary. • More useful measure: normalized scores. • Converting a raw score to a normalized score requires a matrix-specific constant, • called lambda. • Lambda is approximately the inverse of the original scaling factor. • The observed frequencies for all pairs sum up to 1: Write as where Sij are now the raw scores (integer values). Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  9. Towards Karlin-Altschul statistical theory • Thus, a pairwise frequency (qij) is implied from individual amino acid frequencies (piund pj) and a normalized score (λSij). • Need to find λso that: Once λis estimated, it is used to calculate the E-value of every BLAST hit. The expected score of a scoring matrix is the sum of its raw scores weighted by their frequencies of occurrence. Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  10. Karlin-Altschul Statistik • Karlin und Altschul leiteten daraus nun die Bewertung der Signifikanz eines Alignments ab (hier ohne Herleitung): • Fünf zentrale Annahmen: • eine positive Bewertung muß möglich sein • die erwartete Bewertung muß negativ sein • die Buchstaben einer Sequenz sind voneinander unabhängig und gleichverteilt • die Sequenzen sind unendlich lang sequences • Alignments enthalten keine gaps Die Anzahl an Alignments (E), die man während einer Suche in einer Sequenzdatenbank zufällig erhält, ist eine Funktion der Größe des Suchraums (m*n), der normalisierten Austauschbewertungen (λS), und einer Konstanten (k). Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  11. Bewertungs- oder Austausch-Matrizen • dienen um die Qualität eines Alignments zu bewerten • FürProtein/Protein Vergleiche: eine 20 x 20 Matrix für die Wahrscheinlichkeit mit der eine bestimmte Aminosäure gegen eine andere durch zufällige Mutationen ausgetauscht werden kann. • Der Austausch von Aminosäuren ähnlichen Charakters (Ile, Leu) ist wahrscheinlicher (hat einen höheren Score) als der von Aminosäuren unterschiedlichen Charkters (e.g. Ile, Asp). • Matrizen werden als symmetrisch angenommen, besitzen also Form einer Dreiecksmatrix. Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  12. Substitutions-Matrizen • Nicht alle Aminosäuren sind gleich • Einige werden leichter ausgetauscht als andere • Bestimmte Mutationen geschehen leichter als andere • Einige Austausche bleiben länger erhalten als andere • Mutationen bevorzugen bestimmte Austausche • Einige Aminosäuren besitzen ähnliche Codons • Diese werden eher durch Mutation der DNA mutiert • Selektion bevorzugt bestimmte Austausche • Einige Aminosäuren besitzen ähnliche Eigenschaften und Struktur Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  13. PAM250 Matrix Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  14. Beispiel für eine Bewertung • log (A B) = log A + log B •  Die Bewertung (Score) eines Alignments ist die Summe aller • Bewertungen für die Paare an Aminosäuren (Nukleinsäuren) des Alignments: • Sequenz 1: TCCPSIVARSN • Sequenz 2: SCCPSISARNT • 1 12 12 6 2 5 -1 2 6 1 0=> Alignment Score = 46 Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  15. Dayhoff Matrix (1) • wurde von M.O. Dayhoff aufgestellt, die statistische Daten über die Austauschhäufigkeit von Aminosäuren sammelte • Datensatz von eng verwandten Proteinsequenzen (> 85% Identität). • Diese können zweifelsfrei aligniert werden. • Aus der Frequenz, mit der Austausche auftreten, wurde die 20 x 20 Matrix für die Wahrscheinlichkeiten aufgestellt, mit der Mutationen eintreten. • Diese Matrize heisst PAM 1. Ein evolutionärer Abstand von 1 PAM (point accepted mutation) bedeutet, dass es 1 Punktmutation pro 100 Residuen gibt, bzw. Dass die beiden Sequenzen zu 99% identisch sind. Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  16. Dayhoff Matrix (2) • Log odds Matrix: enthält den Logarithmus der Elemente der PAM Matrizen. • Score der Mutation i j • beobachtete Mutationsrate i  j= log( ) • aufgrund der Aminosäurefrequenz erwartete Mutationsrate • Die Wkt zweier unabhängiger Mutationsereignisse ist das Produkt der Einzelwahrscheinlichkeiten. • Bei Verwendung einer log odds Matrix (d.h. bei Verwendung der logarithmisierten Werte) erhält man den gesamten Score des Alignments als Summe der Scores für jedes Residuenpaar. Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  17. Dayhoff Matrix (3) • Aus PAM 1 kann man Matrizen für grössere evolutionäre Entfernungen herstellen indem man die Matrix mehrfach mit sich selbst multipliziert. • PAM250: • 2,5 Mutationen pro Residue • entspricht 20% Treffern zwischen zwei Sequenzen, • d.h. man beobachtet Änderungen in 80% der Aminosäurepositionen. • Dies ist die Default-Matrize in vielen Sequenzanalysepaketen. Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  18. BLOSUM Matrix • Einschränkung der Dayhoff-Matrix: • Die Matrizen, die auf dem Dayhoff-Modell der evolutionären Raten basieren, sind von eingeschränktem Wert, da ihre Substitionsraten von Sequenzalignments abgeleitet wurden, die zu über 85% identisch sind. • Ein anderer Weg wurde von S. Henikoff und J.G. Henikoff eingeschlagen, welche lokale multiple Alignments von entfernter verwandten Sequenzen verwendeten. • Ihre Vorteile: • grössere Datenmengen • multiple Alignments sind robuster Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  19. BLOSUM Matrix (2) • Die BLOSUM Matrizen (BLOcks SUbstitution Matrix) basieren auf der BLOCKS Datenbank. • Die BLOCKS Datenbank verwendet das Konzept von Blöcken (lückenlose Aminosäure-Signaturen), die charakteristisch für eine Proteinfamilie sind. • Aus den beobacheten Mutationen innerhalb dieser Blöcke wurden Austauschwahrscheinlichkeiten für alle Aminosäurepaare berechnet und für eine log odds BLOSUM matrix benutzt. • Man erhält unterschiedliche Matrizen indem man die untere Schranke des verlangten Grads an Identität variiert. • z.B. wurde die BLOSUM80 Matrix aus Blöcken mit > 80% Identität abgeleitet. Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  20. Welche Matrix soll man benutzen? • Enge Verwandtschaft (Niedrige PAM, hohe Blosum)Entfernte Verwandtschaft (Hohe PAM, niedrige Blosum) • Vernünftige Default-Werte: PAM250, BLOSUM62 Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  21. Gewichtung von Lücken (Gaps) • Neben der Substitutionsmatrix braucht man auch eine Methode zur Bewertung von Lücken. • Welche Bedeutung haben Insertionen und Deletionen im Verhältnis zu Substitutionen? • Unterscheide Einführung von Lücken: • aaagaaa • aaa-aaa • von der Erweiterung von Lücken: • aaaggggaaa • aaa----aaa • Verschiedene Programme (CLUSTAL-W, BLAST, FASTA) empfehlen unterschiedliche Default-Werte, die man wohl erst einmal verwenden sollte. Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  22. Needleman-Wunsch Algorithmus • - allgemeiner Algorithmus für Sequenzvergleiche • - maximiert einen Ähnlichkeitsscore • - bester Match = grösste Anzahl an Residuen einer Sequenz, die zu denen einer anderen Sequenz passen, wobei Deletionen erlaubt sind. • - Der Algorithmus findet durch dynamische Programmierung das bestmögliche GLOBALE Alignment zweier beliebiger Sequenzen • - NW beinhaltet eine iterative Matrizendarstellung • alle möglichen Residuenpaare (Basen oder Aminosäuren) – je eine von jeder Sequenz – werden in einem zwei-dimensionalen Gitter dargestellt. • alle möglichen Alignments werden durch Pfade durch dieses Gitter dargestellt. • - Der Algorithmus hat 3 Schritte: 1 Initialisierung 2 Auffüllen 3 Trace-back Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  23. Needleman-Wunsch Algorithm: Initialisierung • Aufgabe: aligniere die Wörter “COELACANTH” und “PELICAN” der Länge m =10 und n =7. Konstruiere (m+1) (n+1) Matrix. • Ordne den Elementen der ersten Zeile und Reihe die Werte – m  gap und – n  gap zu. • Die Pointer dieser Felder zeigen zurück zum Ursprung. Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  24. Needleman-Wunsch Algorithm: Auffüllen • Fülle alle Matrizenfelder mit Werten und Zeigern gemäss von simplen Operationen, die die Werte der diagonalen, vertikal, und horizontalen Nachbarzellen einschliessen. Berechne • match score: Wert der Diagonalzelle links oben + Wert des Alignments (+1 oder -1) • horizontal gap score: Wert der linken Zelle + gap score (-1) • vertical gap score: Wert der oberen Zelle + gap score (-1) • ordne der Zelle das Maximum dieser 3 Werte zu. Der Pointer zeigt in Richtung des maximalen Scores. • max(-1, -2, -2) = -1 • max(-2, -2, -3) = -2 • (Pointer soll bei gleichen Werte immer in eine bestimmte Richtung zeigen, z.B. • entlang der Diagonalen. Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  25. Needleman-Wunsch Algorithmus: Trace-back • Trace-back ergibt das Alignment aus der Matrix. • Starte in Ecke rechts unten und folge den Pfeilen bis in die Ecke links oben. • COELACANTH • -PELICAN-- Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  26. Smith-Waterman-Algorithmus • Smith-Waterman ist ein lokaler Alignment-Algorithmus. SW ist eine sehr einfache Modifikation von Needleman-Wunsch. Lediglich 3 Änderungen: • die Matrixränder werden auf 0 statt auf ansteigende Gap-Penalties gesetzt. • der maximale Wert sinkt nie unter 0. Pointer werden nur für Werte grösser als 0 eingezeichnet. • Trace-back beginnt am grösseten Wert der Matrix und endet bei dem Wert 0. • ELACAN • ELICAN Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  27. FASTA Algorithmus – Schritt 1 • FASTA ist eine heuristische Methode zum Vergleich zweier Zeichenfolgen. • Der Algorithmus wurde 1985 von Lipman und Pearson entwickelt und 1988 verbessert. • FASTA vergleicht einen Eingabestring gegen eine einzelne Buchstabenfolge. • Wenn man eine ganze Datenbank nach Treffern zu einer Eingabesequenz absucht, • vergleicht FASTA die Eingabesequenz mit jedem Eintrag der Datenbank. • Der Algorithmus nimmt an, daß ein Alignment zweier Sequenzen einen Abschnitt mit absoluter Übereinstimmung enthält und konzentriert sich auf identische Regionen. • Dies sind die einzelnen Schritte des FASTA-Algorithmus • 1. • Wir geben einen ganzzahligen Parameter ktup vor (für k respective tuples), and suchen nach identischen Substrings der Länge ktup in beiden Sequenzen. • Die empfohlenen Werte für ktup sind 6 für DNA- und 2 für Proteinsequenzvergleiche. • Die passenden Substrings der Länge ktup bezeichnet man als hot spots. Aufeinander folgende hot spots werden entlang der Diagonale der dynamischen Programmierung gefunden • Dieser Schritt läßt sich effizient mit einer lookup- oder hash-Tabelle durchführen: Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  28. Lookup-Methode • Position 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 • Sequenz 1 n c s p t a ... • Sequenz 2 a c s p r k • Position in • Aminosäure Protein A Protein B pos A – pos B • a 6 6 0 • c 2 7 -5 • k - 11 • n 1 - • p 4 9 -5 • r - 10 • s 3 8 -5 • t 5 • Aminosäuren c, s, und p haben den gleichen Offset. So erhält man schnell das mögliche • Alignment. Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  29. FASTA Algorithmus – Schritt 2 • Finde nun die 10 besten Diagonalläufe der Hot spots in der Matrix. • Eine Diagonale ist eine Reihe von benachbarten hot spots auf der gleichen Diagonale (müssen nicht unbedingt auf der Diagonale benachbart sein, d.h. • Zwischenräume zwischen den hot spots sind erlaubt). • In einem Duchlauf müssen nicht alle hot spots auf der Diagonale liegen und die Diagonale kann mehr als einer der 10 besten Durchläufe enthalten. • Um die Diagonalen-Durchläufe zu bewerten gibt FASTA jedem hot spot eine positive Bewertung und den Zwischenräumen zwischen aufeinanderfolgenden hot spots eines Runs eine negative Bewertung, die mit zunehmender Entfernung abnimmt. Dann wird die Summe gebildet. • Mit diesem Bewertungsschema findet FASTA die 10 Diagonalläufe mit der höchsten Bewertung. Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  30. FASTA Algorithmus – Schritt 3 Ein Diagonalenlauf bezeichnet ein Paar von alignierten Substrings. Das Alignment setzt sich aus Treffern (hot spots) und Nichttreffern (dazwischen) zusammen. Es enthält jedoch keine Indels, da es aus einer einzigen Diagonale besteht. Als nächstes bewerten wir die Läufe mit einer Aminosäure- (Nukleotid-) Austauschmatrix und wählen den besten Lauf. Das beste einzelne Teilalignment in diesem Schritt heisst init1. Weiterhin wird eine Filterung durchgefühhrt und alle Diagonalläufe mit relativen geringen Bewertungen gelöscht. Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  31. FASTA Algorithmus – Schritt 4 Bis jetzt wurden keine Indels in den Teilalignments erlaubt. Wir versuchen nun, „gute“ Diagonalläufe aus eng benachbarten Diagonalen zu kombinieren, und erreichen dadurch ein Teilalignment mit Indels. Die „gute“ Teilalignments stammen aus dem vorherigen Schritt (Bewertung > als ein cut-off Wert) und versuchen, sie zu einem einzigen großen Alignment mit hoher Bewertung zu kombinieren, das einige Gaps enthält. Dazu konstruieren wir einen gerichteten, gewichteten Graph, dessen Vertices die Teilalignments aus dem vorherigen Schritt sind. Das Gewicht jedes Vertix entspricht der Bewertung des entsprechenden Teilalignments. Dann verbinden wir Vertex u mit Vertex v falls das Teilalignment von v in einer tieferen Reihe beginnt als es endet. Wir geben dieser Verbindung ein negatives Gewicht, das der Anzahl an zwischen u und v einzufügenden Gaps entspricht. FASTA bestimmt dann in diesem Graphen einen Pfad mit maximalem Gewicht. Dieses ausgewählte Alignment entspricht einem einzelnen lokalen Alignment der beiden Strings. Das beste Alignment in diesem Schritt wird mit initn bezeichnet. Wie im vorherigen Schritt werden Alignments mit relativ geringer Bewertung gelöscht. Dann kommen noch 2 weitere Schritte ... Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  32. FASTA Algorithmus – graphisch Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  33. BLAST – Basic Local Alignment Search Tool • Findet das am besten bewertete lokale optimale Alignment einer Testsequenz mit allen Sequenzen einer Datenbank. • Sehr schneller Algorithmus, 50 mal schneller als dynamische Programmierung. • Kann verwendet werden um sehr grosse Datenbanken zu durchsuchen, da BLAST eine vor-indizierte Datenbank benutzt • Ist ausreichend sensititv und selektiv für die meisten Zwecke • Ist robust – man kann üblicherweise die Default-Parameter verwenden Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  34. Test Sequenz L N K C K T P Q G Q R L V N Q P Q G 18 Wort P E G 15 benachbarte P R G 14 Wörter P K G 14 P N G 13 P M G 13 P Q A 12 unterhalb Schranke(T=13) P Q N 12etc. BLAST Algorithmus, Schritt 1 • Für ein gegebenes Wort der Länge w (gewöhnlich 3 für Proteine) und eine gegebene Score-Matrix • Erzeuge eine Liste aller Worte (w-mers), die einen Score > T erhalten, wenn man sie mit dem w-mer der Eingabe vergleicht P D G 13 Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  35. P Q G 18 P E G 15 PMG P R G 14 Database P K G 14 P N G 13 P D G 13 P M G 13 BLAST Algorithmus, Schritt 2 • jedes benachbarte Wort ergibt alle Positionen in der Datenbank, in denen es gefunden wird (hit list). Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  36. Traditional BLAST programs Search Space Sequence 2 Alignments Gapped alignments Sequence 1 Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  37. Seeding Sequence 2 Word hits Sequence 1 Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  38. Neighboorhood for 3-letter words • BLOSUM62 PAM200 • Word Score Word Score • RGD 17 RGD 18 • KGD 14 RGE 17 • QGD 13 RGN 16 • RGE 13 KGD 15 • EGD 12 RGQ 15 • HGD 12 KGE 14 • NGD 12 HGD 13 • RGN 12 KGN 13 • AGD 11 RAD 13 • MGD 11 RGA 13 • RAD 11 RGG 13 • RGQ 11 RGH 13 • RGS 11 RGK 13 • RND 11 RGS 13 • RSD 11 RGT 13 • SGD 11 RSD 13 • TGD 11 WGD 13 Choice of cut-off T will affect seeding Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  39. Seeding Sequence 2 Sequence 1 Word clusters Isolated words Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  40. BLAST Algorithm: Extension • Program tries to extend seeds in both directions by adding residue pairs until the added score is smaller than a cut-off. • After terminating the extension, the alignment is trimmed back to that with the maximal score. Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  41. PSI-BLAST • “Position-Specific Iterated BLAST” • Entfernte Verwandtschaften lassen sich besser durch Motiv- oder Profil-Suchen entdecken als durch paarweise Vergleiche • PSI-BLAST führt zunächst eine BLAST-Suche mit Gaps durch. • Das PSI-BLAST Programm verwendet die Information jedes signifikanten Alignments um eine positionsspezifische Substitionsmatrix zu konstruieren, die an Stelle der Eingabesequenz in der nächsten Runde der Datenbank-Suche verwendet wird. • PSI-BLAST kann iterativ verwendet werden bis keine neuen signifikanten Alignments mehr gefunden werden. Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  42. BLAST Input • Notwendige Schritte um BLAST einzusetzen (im Zeitalter des Internets!): • Wähle einen Webserver (EBI = European Bioinformatics Institute, NCBI = National Center for Biotechnology Information …) • gib Testsequenz ein (cut-and-paste) • wähle die Nukleotid bzw. Aminosäure-Sequenzdatenbank, die durchsucht werden soll • wähle Parameter um Output zu steuern (Zahl der Sequenzen …) • wähle Parameter für das Alignment (z.B. Austauschmatrix, Filter,….) • Testsequenz =MAFIWLLSCYALLGTTFGCGVNAIHPVLTGLSKIVNGEEAVPGTWPWQVTLQDRSGFHFCGGSLISEDWVVTAAHCGVRTSEILIAGEFDQGSDEDNIQVLRIAKVFKQPKYSILTVNND ITLLKLASPARYSQTISAVCLPSVDDDAGSLCATTGWGRTKYNANKSPDKLERAALPLLT NAECKRSWGRRLTDVMICGAASGVSSCMGDSGGPLVCQKDGAYTLVAIVSWASDTCSASS GGVYAKVTKIIPWVQKILSSN Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  43. BLAST Output (1) Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  44. BLAST Output (2) Kleine Wahrscheinlichkeit deutet an, dass der Treffer wohl nicht zufällig zustande kam. Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  45. BLAST Output (3) Niedrige Scores mit hohen Wahrscheinlickeiten deuten an, dass dies wohl keine guten Treffer sind. Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  46. Bedeutung des Alignments in BLAST • P-Wert (Wahrscheinlichkeit) • Gibt die Wahrscheinlichkeit an, mit der der Score eines Alignments zufällig zustande kommen kann. • Je näher P bei Null liegt, desto grösser die Sicherheit, dass ein gefundener Treffer ein richtiger Treffer (homologe Sequenz) ist. • E-Wert (Erwartungswert) • E = P * Anzahl der Sequenzen in Datenbank • E entspricht der Anzahl an Alignments eines bestimmten Scores, die man zufällig in einer Sequenz-Datenbank dieser Grösse erwartet • (wird z.B. für ein Sequenzalignment E=10 angegeben, erwartet man 10 zufällige Treffer mit dem gleichen Score). Dieses Alignment ist also nicht signifikant. • Treffer werden in BLAST nur ausgegeben, wenn der E-Wert unterhalb einer Schranke liegt. Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  47. Grobe Anhaltspunkte • P-Wert (Wahrscheinlichkeit) – A. M. Lesk • P  10-100 genaue Übereinstimmung • P zwischen 10-100 und 10-50 nahezu identische Sequenzen, zum Beispiel Allele oder SNPs • P zwischen 10-50 und 10-10 eng verwandte Sequenzen, • Homologie gesichert • P zwischen 10-10 und 10-1 in der Regel entfernte Verwandte • P > 10-1 Ähnlichkeit vermutlich nicht signifikant • E-Wert (Erwartungswert) • E  0,02 Sequenzen vermutlich homolog • E zwischen 0,02 und 1 Homologie ist nicht auszuschliessen • E  1 man muss damit rechnen, dass diese gute • Übereinstimmung Zufall ist. Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  48. Traditional BLAST programs • Program Database Query Typical uses • BLASTN Nucleotide Nucleotide Mapping oligonucleotides, cDNAs and PCR products to a genome, screening repetitive elements; cross-species sequence exploration; annotating genomic DNA; clustering sequencing reads • BLASTP Protein Protein Identifying common regions between proteins; collecting • related proteins for phylogenetic analyses • BLASTX Protein Nucleotide Finding protein-coding genes in genomic DNA; determining • translated into if a cDNA corresponds to a known protein • protein • TBLASTN Nucleotide Protein Identifying transcripts, potentially from multiple organisms, • translated similar to a given protein; mapping a protein to genomic DNA into protein • TBLAST Nucleotide Nucleotide Cross-species gene prediction at the genome or transcript • translated into translated into level; searching for genes missed by traditional methods • protein protein or not yet in protein databases Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  49. BLAST Output (4) Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

  50. BLAST Output (5) Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

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