第四章 植物组织培养的 基本操作技术

1. 第四章 植物组织培养的基本操作技术

2. 1 器皿、工具的洗涤 • 要用洗涤剂去掉油脂和有机物；用1%左右的盐酸可将可溶性无机物洗去 • 对难洗的或太脏的器皿有时要浸泡过夜 • 洗后口向下或垂直放置，晾干或烘干备用；带刻度的器皿不能烘干，急用的？ • 污染的一次性消耗品或装有曾污染的培养基或组织的器皿，要在高压灭菌 后再处理。

3. 洗液的配制 • 40克工业用重铬酸钾溶于加热100毫升水，冷却后慢慢加900毫升工业用浓硫酸，边加边搅拌，在玻璃缸或瓷缸中加盖备用。

4. 2 灭菌方法 • 培养基营养丰富，适合微生物生长，极易污染，微生物生长大大快于植物学组织，大量消耗营养 污染微生物还可能大量分泌和排泄一些对植物学有毒害的物质，使培养的植物组织难以生活下去

5. 不与微生物或病理工作者共用组织培养工作区 一但发现污染，立即将污染的培养物拿出培养室进行灭菌处理 为防止污染，应注意；

6. 有菌的概念 • 凡是暴露在空气中未经处理的物体，曾经接触过自然水源的物体表面，都是有菌的 • 菌的特点是无处不在，无孔不入，在自然而然条件下忍耐力强。生活条件下要求简单，繁殖力强。 • 菌：包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其它微生物。这些生物个体极小，肉眼看不到。

7. 无菌的概念 • 经过高温灼热或煮过足够长时间的物体，经其它物理或化学灭菌方法处理后的物体，有可能是无菌的。 • 高层大气、岩石内部、健康的植物动物内部不与外表面接触的组织内部有可能是无菌的 • 强酸强碱、化学灭菌剂等是无菌的

8. 杀菌方法 • 物理方法：高温 湿热（121 1.1 15-20分钟 ） 和干热（160-180 2-3小时） 高压锅操作加水 放入物品 加热 排除冷空气 稳压 冷却 接种工具、瓶子、滤膜、针头、针管、容器等到可用这种方法

9. 射线、超声波、微波、滤膜离心沉淀、大量无菌水反复冲洗等，射线、超声波、微波、滤膜离心沉淀、大量无菌水反复冲洗等，

10. 化学方法：各种化学药剂 双氧水、来苏水、升汞、新洁尔灭等 • 空气的过滤灭菌 超净工作台的工作原理就是通过不同等级的细菌过滤膜创造一个无菌的空间

11. 液体的过滤灭菌 使用孔径0.45微米或更小的滤膜 1先对滤膜、细菌过滤器、无菌液收集容器等进行高温高压灭菌 2在超净工作台上等培养基冷却至40度左右时加入灭菌后的过滤液，混匀放置备用。 3不能在培养基温度较高时加入，防止不耐热物质的分解

12. 接种用具的灭菌 • 接种服、帽子、口罩的灭菌 • 塑料器皿 的灭菌

13. 3 植物材料的表面灭菌 • 接种就是将处理好的无菌的外植体经过无菌操作放置在灭过菌的培养基上过程 • 外植体的采集 刷洗 冲洗 表面灭菌 70%的酒精 穿透菌孢子的能力最强 表面活性剂1%吐温80或吐温20 或Triton-X 其它灭菌剂 灭菌剂对植物也是在毒的，要注意浓度和时间

14. 表-1 常用外植体消毒剂的性质和消毒效果比较 化合物 应用浓度范围 清除程度 处理时间/min 备注 非常有效 5-30 次氯酸钠 +++ 1%-1.4%* +++ 5-30 非常有效 9%-10% 次氯酸钙 有 效 +++++ 5-15 10%-12% 过氧化氢 非常有效 2-10 +++ 1%-2% 溴 水 有效 5-30 + 1% 硝酸银 2-10 满意 + 氯化汞 0.01%-0.1% 有效 30-60 ++ 4-50mg/l 抗生素 *市售溶液的浓度通常为20%（体积分数）；注“+”越多表示清除程度越高。

15. 茎尖、茎段或叶片 刷洗 2-10%次氯酸钠泡4-15分钟 无菌水冲洗2-3 • 果实、种子自来水冲洗10-20分 • 花药 70%酒精几秒 无菌水冲洗2-3次 10%漂白粉10分钟 无菌水冲洗2-3次 • 根及地下器官 • 难灭菌 的用0.1-0.2%的升汞或者1-2%的溴水

16. 4无菌操作技术 • 提前准备工作 • 操作时的注意 外植体接种全过程： 酒精擦拭手 外植体消毒浸泡 器械消毒 酒精擦拭培养皿 取外植体 修剪外植体 旋转灼烧瓶口 接种 封口

17. 5 组织培养中常见问题解决 • （1）褐化 • 培养过程中细胞中多酚氧化酶激活后，酚类被氧化成棕褐色的醌类物质，这种致死性物质会扩散，使培养基变褐，还会抑制其它酶的活性，严重影响外植体的脱分化和器官分化，最后变褐死亡。

18. 1.植物种类和品种 2.生理状态 • 处于幼龄期的植物材料较从成年植株采集的植物材料褐化程度轻；老熟组织较幼嫩组织褐化程度严重 。 • 处于生长季节的植物体内含有较多的酚类化合物，所以夏季时取材更容易发生褐化，冬春季节取材则材料褐化死亡率最低 注意取材时间和部位

19. 3.培养基成份 • 无机盐浓度过高会使某些观赏植物的褐化程度增加；细胞分裂素水平过高也会刺激某些外植体的多酚氧化酶的活性，从而使褐化现象加重。 4.培养条件不当 • 如果光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速培养材料的褐化程度。 5.其它原因

20. 防治措施 • 选择适宜的外植体和培养基 适当降低培养基的无机盐、降低PH值、降低细胞分裂素水平等 • 连续转移 • 加抗氧化剂，如抗坏血酸、硫代硫酸钠、牛血清蛋白、PVP（聚乙烯吡咯烷酮） • 加活性炭 0.1-0.5% • 加多胺类物质，如精胺、亚精胺

21. （2）玻璃化 • 组培苗含水量过高，茎叶呈透明状、叶片卷曲等到畸形，不能生根移栽

22. 玻璃化苗的症状表现 • 试管苗矮小肿胀，失绿，茎叶表皮无蜡质层，无功能性气孔，叶、嫩梢呈水晶透明或半透明； • 叶片皱缩并纵向卷曲，脆弱易碎； • 组织发育不全或畸形；体内含水量高，干物质等含量低； • 试管苗生长缓慢，分化能力下降，难以诱导生根，移栽成活率极低，因而繁殖系数低。

23. 原因 • 植物种类 • 培养基硬度和离子比例 • 培养基中激素 CTK高 • 环境湿度

24. 措施 • 适当控制培养基中离子浓度 • 适当控制培养基中糖和琼脂 的量 • 适当降低CTK和GA的浓度 • 控制好湿度 • 增加自然光照，控制光照时间 • 改善培养瓶的气体交换情况 • 在培养基中添加其它物质

25. （3）污染 • 污染源有细菌和真菌两类 • 培养基污染的可能性来源：

26. 细菌污染 （1）现象 在培养材料附近出现粘液状物或混浊的水迹痕 或出现泡沫塑料的发酵状情况 或在培养基中出现浑浊和云雾状痕迹 特点是菌斑呈现粘液状物，通常 在接种后1-2天就可发现

27. （2）原因 材料带菌 培养基灭菌不彻底 工作人员的操作：如使用了未经灭菌的工具、呼吸时呼出细菌、手接触了材料或是器皿边缘使微生物落入等

28. （3）防治方法 手的清洁与灭菌 接种操作中要接几瓶就用70%酒精擦拭，工具要常灼烧灭菌 丢弃污染的一次性消耗品也要先高温高压灭菌后，减少污染源

29. 真菌污染 • （1）现象 • 培养基上长霉，接种3-5天能发现，有白、黄、黑色的 • 特点是污染部位长出不同颜色的霉菌，在接种3天后，有时10天才能表现出颜色和症状

30. （2）原因 • 通常 是周围环境不清洁或空气污染造成 • 接种室不清洁，灰尘太多 • 超净工作台的过滤装置失效 • 培养用器皿口径太大 • 操作不慎，如打开瓶塞时使瓶口边的真菌孢子落入，解开包头纸或橡皮筋时弹起了真菌孢子，污染了空间

31. （3）防治方法 • 接种室的空气循环灭菌和紫外灭菌要严格 • 工作台的空气过滤装置要常检查并提前开启 • 接种时要规范，如去掉棉塞、打开橡皮筋时动作要轻，去掉瓶塞后瓶子要拿成斜角等。 • 丢弃污染的一次性消耗品也要先高温高压灭菌后，减少污染源

32. 思考题 • 1 植物组织培养中杀菌方法有哪些？即如何做到各个环节上的无菌？ • 2 植物学组织培养中常出现的问题有哪些？如何尽量避免之？