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Methodenvergleich PCR-SSP/SSO

Methodenvergleich PCR-SSP/SSO. Testsysteme SSP:BAG,Dynal,Olerup SSO:Elpha,Dynal Reli. Vergleich SSP-SSO. SSP: Sequenz spezifische Primer SSO: Sequenz spezifische Oligonukleotide Elpha: Enzyme linked probe hybridization essay Reli: reverse line dot blot essay.

yvonne
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Methodenvergleich PCR-SSP/SSO

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Presentation Transcript

  1. Methodenvergleich PCR-SSP/SSO Testsysteme SSP:BAG,Dynal,Olerup SSO:Elpha,Dynal Reli

  2. Vergleich SSP-SSO SSP: Sequenz spezifische Primer SSO: Sequenz spezifische Oligonukleotide Elpha: Enzyme linked probe hybridization essay Reli: reverse line dot blot essay

  3. Vergleich SSP-SSO • Überprüft auf : • Eindeutigkeit des Ergebnisses • Notwendigkeit von Wiederholungen • Auflösungsvermögen und detektierte Allele • methodische Probleme • Auswertung • Kosten und Materialverbrauch • Zeitaufwand

  4. SSP Ergebnis nachAmplifikation Zeitgewinn SSO Cyclerbedarfgeringer Probendurchsatzgrößer DNA-Bedarf geringer oft bereits im low-resolution-Set hohe Auflösung Vergleich SSP - SSO

  5. Prinzip der PCR-SSP Genomischer DNA-Doppelstrang bei Erhitzung auf >92°C denaturiert.

  6. Prinzip der PCR-SSP Primerannealing bei 37 - 72°C 5´ Antisenseprimer 3´ 3´ Senseprimer 5´

  7. Prinzip der PCR-SSP Elongation durch Taq-Polymerase bei 72°C Wiederholung Denaturierung, Annealing und Elon- gation, bis PCR-Cyclen beendet. 5´ 3´ 3´ 5´

  8. Prinzip des Dynal RELI Strepavidin- konjugiertes Reportermolekül macht Bindung sichtbar (enzymatisch..) Ziel-DNA wird mit biotinmarkierten Primern amplifiziert und dena- turiert auf die Membran gegeben SSO-Moleküle werden auf Membran immobilisiert

  9. Erscheinung des Reli-Test

  10. Prinzip des Elpha Im letzten Schritt wird das Substrat, z.B. O-phenylene- diamin, als Farbreaktion umgesetzt Capture Oligo- nukleotid ist an Wand des Reaktions- gefäßes fixiert Streptavidin- reportermolekül ist mit Enzym gekoppelt, das Substratum- wandlung ver- mittelt PCR-amplifizierte biotinylierte DNA bindet an fixiertes SSO

  11. Erscheinung Elpha-Test

  12. Vergleich SSP - SSO SSP Elpha Reli

  13. Vergleich SSP-SSO • 27 Proben DRB und 26 Proben DQB in Vergleich • je 4 Homozygote in DRB und DQB • pro Probe DRB:BAG,Elpha,Reli DQB:Dynal/Olerup,Elpha, Reli • 1 x DQB-SSP allein, 2 x DQB SSP-Reli

  14. Vergleich SSP-SSO • SSP Elpha Reli • Cycler 47 Min 33,5 Min 48,75 Min(reine Ampl.) • Detektion 18 Min 110 Min 100 Min(ohne Auswertung) • DNA 12/30 µl 4/2 µl 4 µl(100 ng/ml) • DNA 1:1 1:19/1:22 1:72Verdünnung DQB DRB • Schritte 2 12 21ohne Amplifikation

  15. Vergleich SSP-SSOKosten pro Test • SSP Elpha Reli • Kitpreis pro Bestimmung DRB 37,- 65,- 45,- DQB 15/12 65,- 42,- • Reagenzien dNTP-Puffer 10,5 • Taq Polymerase 0,86/0,36 0,36 inklusive • RestkostenMaterial, Fotographie, Zeit... 1,50 6/12Pf 6 Pf

  16. Vergleich SSP-SSOHomozygotenerkennung • SSP Elpha ReliDRB 1/4 1/4 1/4erkannt 4,-nicht erkannt 3,-;15,-;13,- • DQB 3/4 2/4 4/4erkannt 6,-;2,- 6,-;2,- 6,-;2,-nicht erkannt 6,- 6,-;2,-

  17. DRB-Allele der Sets

  18. DQB-Allele der Sets

  19. Reli-Auswerteprogramm

  20. Elpha-Auswerteprogramm

  21. Vergleich SSP-SSOElpha-Frequenzentscheidung

  22. Vergleich SSP-SSOAllelfrequenzen DQB (KM)

  23. Vergleich SSP-SSOeindeutige Ergebnisse • SSP Elpha Reli h/v a/v DR2 DR2DRB 63% 85% 19% 52% 41% 70% • SSP Elpha Relialle PrimerausfallDQB 93% 77% 75% 100%

  24. Vergleich SSP-SSOAuflösung • DRB SSP 15,5% Elpha h/v 82% a/v 19,6% Reli 48,3% • DQB SSP 30% Elpha h/v 77% a/v 74% Reli 71%

  25. Vergleich SSP-SSOWiederholungen • SSP Elpha Relih/v a/v DR2 DR2DRB- insgesamt 37% 15% 81% 41% 59% 30%- Ausfälle 19% 7% 11%- Ag Ausschl. 22% 7% 44% 26%- DR2 0% 4% 33% 30% • DQB- insgesamt 7% 62% 0%- Ag Ausschl. 7%- Ausfälle 0% 15%

  26. Vergleich SSP-SSOSSP-Problemfälle • DRB: BAG-Set kann bei Vorliegen von DRB1*13 *1424 nicht sicher ausschließen bei Vorliegen von *13,- kann auch *1130 nicht ausgeschlossen werden bei Vorliegen von *3,- kann auch *1420 nicht ausgeschlossen werden • Sets von Dynal oder Biotest zeigen dieses Problem nicht

  27. Vergleich SSP-SSOSSP-Problemfälle • DQB in einem Fall einer DQB1*06 Homozygotie war ein *0304 nicht auszuschließen in einem Fall einer DQB1*0301 Homozygotie war eine *03032 und *0306 nicht sicher auszuschließen DQ 3 Splitaufteilung nur in DQ 7 möglich

  28. Vergleich SSP-SSOElpha-Problemfälle • DRB bei Vorliegen von DRB1*03/04 und *11/12 ist im Bewertungsmodus alle/vollständig auch *13 und *14 möglich zusätzlich sind bei Vorliegen von *03,*07,*11,*12,*08 ebenfalls *13 oder *14 möglich

  29. Vergleich SSP-SSOElpha-Problemfälle • DQB in Primermixen A oder B trotz positiver Kontrollbande kein spezifisches Amplifikat in 31% der Amplifikationen; in diesen Fällen nur bei 75% korrelierendes Ergebnis Wenn in jedem Mix spezifisches Amplifikat korrektes Ergebnis in 78% d.F.

  30. Vergleich SSP-SSOspezieller Fall Elpha • DNA Probe 990606SSP und Reli DQB1*02,-Elpha-Test:1) alle Kontrollen positiv DQB1* 0301,06012) PM A kein spezif. Amplifikat DQB1* 020x,030x3) PM A kein spezif. AmplifikatDQB1* 02,-

  31. Vergleich SSP-SSOReli-Problemfälle • DRB Bei Vorliegen von 3,- oder 13,- Homozygotie ist auch heterozygote 13,3 möglich Bei HLA-DRB1*11,12 kann *13 nicht ausgeschlossen werden Im Falle DRB1*03,11 wird homozy- got 3,- oder 11,- von der Auswerte- software als wahrscheinlich angegeben

  32. Vergleich SSP-SSOReli Problemfälle • DQB es steht keine Auswertesoftware zur Verfügung

  33. Vergleich SSP-SSOspezieller Fall Reli • DNA Probe 990291SSP-Ergebnis DRB1*03,11Reli Auswertesoftware:1) 0308,-2) 1109,-3) 03xx,03084) 03xx,11xxreproduzierbar

  34. Vorteile: stabile DRB Amplifikation automatisches Waschen Gesamtprozeß-automatisierung verfügbar Mit Update ist eine Auswertung auch früherer Daten hinsichtlich neuer Allele möglich für DR2-Auftrennung werden Primer mitgeliefert Nachteile: instabile DQB Amplifikation je nach Softwareeinstellung werden bestimmte Allele aus der Bewertung ausgeschlossen sehr abhängig von technischer Ausstattung, die bei Defekt die Testdurchführung unmöglich macht Pipettierarbeit zeit- und materialaufwendig Dokumentation der Reaktion nur als Photometermeßwerte im PC und auf Ausdruck viel Material nicht im Lieferumfang Bewertung Elpha-Test

  35. Vorteile: sehr stabile Amplifikationen Testdurchführung mit wenig Materialaufwand Streifen sind zur Dokumentation archivierbar HLA-A und -B bereits verfügbar kaum mechanische oder elektrische Geräte nötig Nachteile: für DQB keine Auswerte-software keine Automatisierung der Waschschritte oder des gesamten Ablaufs verfügbar schlechte optische Aufbereitung des Befundausdrucks Bewertung Reli-Test

  36. Vorteile: stabile Amplifikationen Fotos des Gelbildes zur Dokumentation archivierbar teilweise Automatisierung verfügbar Nachteile: hoher Platzbedarf im Thermocycler ausgefallene Amplifikationen machen Neuansatz des gesamten Sets nötig höhere Kosten für Polymerase mehr Ethidiumbromid-gele als Sonderabfall mehr Pipettieraufwand für einen Patienten Bewertung SSP

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