1 / 43

Solunum Yolu nun Primer Hücre Kültürleri

Solunum Yolu nun Primer Hücre Kültürleri . Prof. Dr. Hasan Bayram Gaziantep Üniversitesi Tıp Fakültesi Göğüs Hastalıkları AD E-posta: bayram@gantep.edu.tr. Toraks 10.Yıllık Kongresi, Antalya 25-29 Nisan 2007. Amaç. Solunum yolunun primer hücre kültürleri hakkında bilgi sahibi olma

zahi
Download Presentation

Solunum Yolu nun Primer Hücre Kültürleri

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Solunum Yolunun Primer Hücre Kültürleri Prof. Dr. Hasan Bayram Gaziantep Üniversitesi Tıp Fakültesi Göğüs Hastalıkları AD E-posta: bayram@gantep.edu.tr Toraks 10.Yıllık Kongresi, Antalya 25-29 Nisan 2007

  2. Amaç • Solunum yolunun primer hücre kültürleri hakkında bilgi sahibi olma • Solunum yolu hücre kültürlerinin araştırmalarda kullanımı ve sağladığı olanaklar hakkında bilgi sahibi olma • Katılımcıları bu yöntemleri öğrenme ve kullanmaları konusunda teşvik etme

  3. İçerik • Neden primer hücre kültürleri; kullanımı, avantajları • Nelere ihtiyaç duyulur? • Düz kas hücreleri • Fibroblast kültürleri • Alveolar epitel hücreleri • Bronş epitel hücreleri

  4. Primer Hava Yolu Hücre Kültürleri – Olanaklar • İn vivo uygulamalarda etik, güvenlik sorunları • Uygun çalışma modeli • Hücre fizyolojisi, biyokimyası vb • Patogenez; rinit, astım, KOAH, kanser • Toksikoloji; kimyasallar, zehirler, çevresel irritanlar (hava kirliliği), biomas • Terapötik; Ca tedavisi, steroidler, 2-agonist, teofilin, yeni ajanlar, vs

  5. Primer Hücreler-Avantajlar • İn vivo ortamdaki hücrelerle genotipik ve fenotipik benzerlik • Çeşitli patolojilerde, hastalardan direkt olarak elde edilebilirler

  6. Primer Hücre Kültürü-Dezavantajlar • Elde edilmeleri daha zor • Tekrar tekrar çoğaltılıp kullanılamazlar • Etik sorunlar

  7. Primer Hava Yolu Hücreleri Nasıl Elde Edilirler?

  8. Biyogüvenlik Kabini

  9. CO2 İnkübatörü • %5 CO2 • 37 °C • Nemlendirilmiş ortam

  10. Hücre Kültür Kapları Hücre Kültür ‘Flask’ı

  11. Hücre Kültürü Vasatı

  12. Doku-Hücre Kaynağı • Hayvan • İnsan

  13. Doku - Hücre Kaynağı • Cerrahi eksplant • Pnömonektomi, Lobektomi • Transplant akciğeri • Biyopsi • Fırçalama (epitel hücreler) • Enzimatik digestion, • Disseksiyon • Hazır, ticari olarak

  14. Hava Yolu Düz Kas Hücreleri

  15. Hava Yolu Düz Kas Hücreleri-1 • Trakea veya bronş halkalarından • Diseksiyon ile düz kas ayrıştırılır, temizlenir, • 1mm3 parçalara ayrılır • Kültür kapları/flasklara konur - Hirst SJ, Eur Respir J 1996; 9:808-820. - Xie S, et al Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2005; 288: L68-L76.

  16. Hava Yolu Düz Kas Hücreleri-2 • Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), %10 fetal buzağı serumu (FCS), L-glutamin, sodium pyruvate,anti-mikrobial ajan • Trypsin ile yerlerinden ayrılır • Kültür kaplarına transfer - Hirst SJ, Eur Respir J 1996; 9:808-820 - Xie S, et al Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2005; 288: L68-L76.

  17. Hava Yolu Fibroblast Kültürleri

  18. Fibroblast Kültürleri • Lobektomi veya pnömonektomi eksplantı • Tümorsüz doku 3-5mm parçacıklara ayrılır • %10 FCS ile kaplanan flasklara konur • Flask yüzeyini kaplayan hücreler tripsin ile yerlerinden ayrılarak ileri pasajlar elde edilir. - Eickelberg O, et al. Am J Physiol 1999; 276: L814–L824.

  19. Alveol Epitel Hücre Kültürleri Alveol epitel Hücreleri ( Tip I ) Bazal membran Alveol epitel Hücreleri ( TipII )

  20. Alveol Epitel Hücre Kültürleri-1 • Konsolide olmayan, hemoraji gelişmeyen AC eksplantı • Pulm. Arter PBS ile infüzyon • Distal hava yollarına elastaz içeren HBSS • Akciğer DNAse ve FCS varlığında kıyılır • Hücreden zengin fraksiyon ayrılır • Santrifüje edilir -Fang X, et al, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2006; 290: L242–L249.

  21. Alveol Epitel Hücre Kültürleri-2 • Tip 2 pnömosit ve alveolar makrofajdan oluşan bant toplanır • Santrifüj edilir • Anti-CD14 ile kaplı manyetik bilyeler ile inkübe edilir • Manyetik bilyeler, mıknatıs ile ayıklanır • Kalan hücreler inkübe edilir -Fang X, et al, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2006; 290: L242–L249.

  22. Primer Bronş Epitel Hücre Kültürleri • Fırçalama, • Enzimatik digestion, • Disseksiyon

  23. Bronş Epitel Hücreleri-FIRÇALAMA • Bronkoskopi ile taze hücreler alınır • Kollajen ile kaplı kültür flasklarına alınır • Serumsuz, hormonla zenginleştirilmiş bronşiyal epitelyum büyüme vasatı • Antibiyotikli ortamda • 37 °C, %5 CO2’li, nemlendirilmiş ortamda inkübasyon Bucchieri, F et al, Am. J. Respir. Crit. Care Med.2001

  24. Bronş Epitelyumunun Disseksiyonu

  25. Kültür Vasatı • ‘Medium 199’ • Foetal bovine serum (2.5ml) • 1ml bovine pancreatic insulin (2.5 g/ml) • 1ml human transferrin (2.5 g/ml) • 1ml epidermal growth factor (20g/ml) • 1ml hydrocortisone (0.36 g/ml) • 1ml L-glutamine (0.02mg/ml) • 1ml antibiyotik/antimikotik solüsyon • 100ml tamamlanır ve 0.2m por çap filtreden geçirilir

  26. Kültür Kapları 6cm çaplı, Falcon ‘Primaria®’’ plastik kültür kapı (Becton Dickinson,UK) 9mm çaplı 24 gözlü, 0.45m por çaplı hücre kültür ‘insert’ diagramı

  27. Doku eksplantından çoğalan hücreler (Hoffman Modulation Contrast Işık Mikroskopu, x300)

  28. Deneye hazır 2-3 haftalık kültürler (Hoffman Modulation Contrast Işık Mikroskopu, x300)

  29. Hücrelerin Elektron Mikroskobik Görünümü M M D S S D x56,000 x30,000

  30. Hücrelerin DEP ile İnkübasyon

  31. Silya Titreşim Frekansının Ölçülmesi

  32. DEP’nin bronş epitel hücre silya titreşim frekansına etkisi Bayram H, et al. Am J Respir CellMol Biol 1998.

  33. Normal kültür ortamında astmatik ve non-astmatik bronş epitel hücrelerinden inflamatuar mediatör salınımı pg/g selüler protein Non-ast. Ast. p<0.05 (log.) p<0.003 p<0.002 YK IL-8 GM-CSF RANTES sICAM-1 Bayram H, et al. J Allergy Clin Immunol 1998.

  34. DEP ile 24s inkübasyondan sonra non-astmatik ve astmatik bronş epitel hücrelerinden IL-8 salınımı Non-asthmatics Asthmatics Bayram H, et al. J Allergy Clin Immunol 1998.

  35. İn vitro Ozon –NO2 Maruziyet Düzeneği NO2 %5 CO2 İn Air

  36. Kültürlerin Elektriksel Direncinin Ölçüm Düzeneği

  37. Ozon ve NO2’e 2-6s maruziyetin atopik astmatik bronşepitel hücre kültürlerinin elektrik direncine etkisi Bayram H, et al. Clin Exp Allergy 2002.

  38. Ozon ve NO2’e 6s maruziyetin astmatik bronş epitel hücrelerinden GM-CSF salınımına etkisi Bayram H, et al. J Allergy Clin Immunol 2001.

  39. Loratadinin 400ppb NO2’nun Bronş EpitelHücrelerinden Yol Açtığı IL-8 Salınımına Etkisi Bayram H, et al. J Allergy Clin Immunol 1999.

  40. Özet • Solunum yolunun primer hücre kültürleri laboratuar ortamında elde edilebilir • Solunum yolu hücrelerinin fizyolojik ve biyokimyasal özellikleri araştırılabilir • Hastalıkların patogenezinin aydınlatılmasında yararlanılabilir • Toksik ajanların etkileri araştırılabilir • Terapötik ajanların etkileri araştırılabilir

  41. Yorum • Bütün dünyanın yaygın olarak kullandığı hava yolu hücre kültürü olanaklarından Türkiye’deki araştırmacılar da yararlanmalıdır

  42. Teşekkür St Bartholomew’s and The Royal London School of Medicine and Dentistry • Prof RJ Davies • Dr JL Devalia • RJ Sapsford • Dr OA Khair • Dr MA Abdelaziz • Dr C Rusznak Dicle Universitesi

  43. Sabrınız İçin Teşekkür Ederim

More Related