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第二章 基因工程中的工具酶

第二章 基因工程中的工具酶. 限制性内切酶 — 主 要用于 DNA 分子的特异切割 DNA 甲基化酶 — 用 于 DNA 分子的甲基化 核酸酶 — 用 于 DNA 和 RNA 的非特异性切割 核酸聚合酶 — 用 于 DNA 和 RNA 的合成 核酸连接酶 — 用 于 DNA 和 RNA 的连接 核酸末端修饰酶 — 用 于 DNA 和 RNA 的末端修饰 其它酶类 -- 用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等. 常用的工具酶：. 一、限制性内切酶. （一）限制修饰系统的种类 （二）限制性内切酶的定义、命名 （三）限制酶的特点

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第二章 基因工程中的工具酶

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  1. 第二章 基因工程中的工具酶 • 限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 • DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 • 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 • 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 • 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 • 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 • 其它酶类--用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等

  2. 常用的工具酶：

  3. 一、限制性内切酶 （一）限制修饰系统的种类 （二）限制性内切酶的定义、命名 （三）限制酶的特点 （四）同裂酶（isoschizomer） （五）限制酶的用途 (六）Ⅱ型限制性内切酶的反应条件 （七）影响限制性内切酶活性的因素

  4. 限制性核酸内切酶 基因的剪刀──限制性内切酶（限制酶） 一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切割点上将DNA 分子切断。目前已发现的限制酶有200多种。

  5. 限制性核酸内切酶 概念 50年代初发现细菌能将外来DNA片段在某些专一位点上切断，从而保证其不为外来噬菌体所感染，而其自身的染色体DNA由于被一种特殊的酶所修饰而得以保护，这种现象叫做限制－修饰 由三个基因位点所控制： hsd R---限制性内切酶 hsd M---限制性甲基化酶 hsd S---控制两个系统的表达 编码 编码 编码

  6. 限制性核酸内切酶 细菌的限制与修饰系统有两方面的作用：一是保护自身DNA不受限制 二是破坏入侵的外源DNA，使之降解 在发现限制性核酸内切酶工作中做出突出贡献的科学家W．Arber、H．Smith和D．Nathans荣获了1978年诺贝尔生物医学奖。 课本10页的图

  7. （一）、限制修饰系统的种类 1.I型：由三个基因构成，hsdR；hsdM；hsdS位于染色体上，三个基因构成一个复合体，能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近切割双链，但切割序列没有专一性。 2.II型：限制与修饰基因产物独立起作用，识别位点（回文序列）严格专一，并在识别位点内将双链切断 3.III型：hsdＭ与hsdＳ基因产物结合成一亚单位，识别位点严格专一（不是回文序列），但切点不专一，往往不在识别位点内部

  8. 限制性核酸内切酶的类型及其特性 注：SAM为5－腺苷甲硫氨酸。

  9. 限制性核酸内切酶的发现 M．Meselson和R．Yuan(1968)最早从大肠杆菌的限制与修饰系统中分离到限制性核酸内切酶，这种酶后来被命名为Ⅰ型限制性核酸内切酶。 1970年，H．O．Smith和K．W．Wilcox首先从流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)分离出第一个Ⅱ型限制性核酸内切酶HindⅡ。

  10. （二）、限制性内切酶的定义、命名 1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶； 狭义指II型限制酶。 2. 命名：取属名的第一个字母大写，取种名的前两个字母小写，构成基本名称。该种中发现的不同的酶按照顺序编号I, II, III等。。 　例如：HindⅢ前三个字母来自于菌种名称Haemophilus influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。 若酶存在于质粒上，则需大写字母表示非染色体遗传因子。 例如：EcoRI表示基因位于Escherichia coli中的抗药性R质粒上。

  11. （三） Ⅱ型限制酶的特点 1. 识别序列长度为4-6碱基对， ２.识别序列呈典型的旋转对称型回文结构 ３.切点大部分在识别序列内部或两侧。 如：EcoRI 5′-GAATTC-3′ ４.富含ＧＣ

  12. （三） Ⅱ型限制酶的特点 5.切割后可产生三种不同的末端 （1） 酶切产生３′-端突起，个数为２或４个核苷酸。如：

  13. （三） Ⅱ型限制酶的特点 （2）酶切产生５ ＇-端突起，个数为２或４个核苷酸

  14. （三） Ⅱ型限制酶的特点 （3） 酶切产生平齐末端

  15. （四）异源同序酶（isoschizomer，同裂酶） 1. 定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制 酶 2. 特点：1）识别相同顺序 2）切割位点的异同 KpnI GGTAC C Asp718 G GTACC SstI CCGC GG SacI CCGC GG 同尾酶（isocaudamer） • 定义：来源各异，识别序列也不相同，但切割后 • 产生相同的黏型末端的酶。 • 如：BamH I GGATCC Bgl II AGATCT

  16. （五）、 限制酶的用途 1.DNA重组 2.限制酶（物理）图谱绘制 3.突变分析（RFLP分析） 4. 限制酶的部分酶切与完全酶切

  17. 酶切图谱的构建（a） 请构建该环状DNA分子的酶切图谱

  18. 酶切图谱的构建（b）

  19. （六）Ⅱ型限制性核酸内切酶的反应条件 一个单位的限制性核酸内切酶定义为：在合适的温度和缓冲液中，在20 uL反应体系中，1h完全降解1ug DNA所需要的酶量。 酶解过程 ①酶解体系 ②混匀 ③反应终止（终浓度为10mmol/L的EDTA或0.1%的SDS) ④酶解结果鉴定

  20. 终止酶反应的方法如下： A．加入乙二胺四乙酸(EDTA)（终浓度10mmol／L，（螯合Mg2+） B．加入十二烷基硫酸钠(SDS)至终浓度0.1％(W／V)，(酶变性) C．酶解溶液于65℃水浴中保温20min，(加热使酶失活) 温度较高的酶不能使之完全失活，如AccⅢ、Bcl工、BstNI、BstXI和TaqI等。 D．用酚／氯仿抽提，然后乙醇沉淀，此法最为有效而且有利于下一步DNA的酶学操作。

  21. （七）影响限制性核酸内切 酶活性的因素 1．酶的纯度 2．DNA样品的纯度 3．DNA的甲基化程度 4．酶切反应的温度与时间 5．DNA分子的构型 6．限制性核酸内切酶的反应缓冲液

  22. 影响限制性核酸内切酶活性的因素 DNA样品的纯度： 蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等 加大酶的用量，1 μg DNA 用10U 酶 加大反应总体积 延长反应时间

  23. 影响限制性核酸内切酶活性的因素 DNA样品的甲基化程度： 大肠杆菌中的dam甲基化酶在5′-GATTC-3′序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有Bcl I、MboI等，但BamH I、Bgl II、Sau3A I不受影响 大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5′-CCAGG -3′或5′-CCTTGG-3′序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoR II等 哺乳动物中的甲基化酶在5′-CG-3′序列中的C5位上引入甲基

  24. 限制性核酸内切酶的反应缓冲液 许多限制性核酸内切酶在出售时都配有10倍的浓缩缓冲液，缓冲液的主要成分包括：Tris—C1、NaCl或KCI和Mg2+。 缓冲液分为三种： 低盐缓冲液L(10mmol／LNaCl)、中盐缓冲液M(50mmol／LNaCl)和高盐缓冲液H(100mmol／LNaCl)。 在缓冲液中添加β—巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)的目的是防止酶氧化，以保持其活性。 加入牛血清蛋白（BSA），防止酶在低浓度蛋白质溶液中变性。 ？当同一DNA样品需要两种以上酶切时，可采用以下方法： 1、先用低离子强度缓冲液的酶切割，再加NaCl调节强度，在酶切。 2、先用一种酶切割，再用乙醇沉淀，产物重悬另一缓冲液中酶切。 3、使用通用缓冲液。

  25. 二、DNA甲基化酶（一）甲基化酶的种类与识别顺序二、DNA甲基化酶（一）甲基化酶的种类与识别顺序 • DNA腺嘌呤甲基化酶 • (DNA adenine methylase,Dam) 识别序列GATC 腺嘌呤N6位置 引入甲基 一般哺乳动物DNA 不会在A-N6上甲基化

  26. 2. DNA胞嘧啶甲基化酶 (DNA cytosine methylase ,Dcm) 识别CCAGG或CCTGG序列 在第二个C上C5位置上引入甲基 受其影响的限制性内切酶是EcoR II

  27. 1. 修饰酶切位点，改变识别序列 (二)II型甲基化酶对限制酶活性的影响 ①抑制同种限制酶的活性 M.TaqI甲基化TCGA中的A，所以M.TaqI处理DNA后，GTCGAC将不受HincII切割 HincII GTCGAC GTCAAC GTTGAC GTTAAC

  28. ②抑制不同种限制酶的活性 BamHI GGATCC M.MspI m5CCGG 如果BamHI前面为CC或后面为GG， 那么M.MspI处理的DNA抵抗BamHI的切割

  29. ③抑制不同种限制酶的部分活性 • 构建DNA文库时 • 用AluI(AG↓CT)和HaeIII(GG↓CC)部分消化基因组DNA • 用M.EcoRI甲基化酶处理， • 然后加上合成的EcoRI接头 • 当再用EcoRI来切割时只有接头上的位点可被切割

  30. 2.产生新酶切位点 • TCGATCGA • AGCTAGCT • TaqI TaqI • M.TaqI • TCGA*TCGA* • *AGCT*AGCT • DpnI

  31. 3. 用于研究细胞DNA中位点特异性甲基化的水平及分布 • 哺乳动物m5CG、植物的m5CG，m5CNG • 肠道细胞的Gm6ATC • C m5/4 CGG MspI可切割，HpaII不可切割Gm6ATC Sau3AI 可切割，MobI不可切割 • 其它

  32. 4.用于基因组文库的建立 RE RE RE RE CH3 RE M.RE CH3 RE RE RE RE CH3 RE RE 5.用于cDNA的连接保护切点 CH3 CH3 RE RE RE 甲基 化酶 人工 接头 RE CH3 与载体相连

  33. 三、核酸酶 是一类能降解核酸磷酸二酯键的水解酶。 分为：内切酶和外切酶 根据对底物的专一性分为： 1、只用于RNA的叫核糖核酸酶（Rnase） 2、只用于DNA的叫脱氧核糖核酸酶（Dnase） 3、即作用于RNA 又可作用于DNA叫核酸酶

  34. （一）核糖核酸酶（Rnase） 大部分用于RNA的核苷酸序列分析或除去DNA样品或蛋白质合成系统中的RNA分子。 1. RNase A 分离自牛胰脏，对热稳定，抗去污剂（100℃加热15min仍具活性）。 用途：除去DNA样品中的RNA分子、 RNA检测、 DNA-RNA杂交分子中未杂交的RNA区、识别错配碱基。 2. 核酸酶S7 亦称微球菌核酸酶，对RNA敏感，用于除去蛋白质合成系统中的内源mRNA 3. RNase H 小牛胸腺中发现。用途：DNA-RNA杂交分子中的RNA链，用于cDNA文库建立时除去RNA链以便第二条链cDNA链的合成。 4. RNase T1 来源于米曲霉，它特异地作用于鸟嘌呤3′端磷酸，活性类似于 RNase A

  35. DNaseI 作用特点 Mn++存在时 Mg++存在时 （二）脱氧核糖核酸酶（Dnase） 1. 特点：具内切酶活性，作用于ds -DNA，但无核苷酸序列特异型，产生5′-P低聚核苷酸; Ca2+ , Mg 2+或Ca2+ , Mn2+可使酶活达最大值 当酶浓度很低时，ds -DNA分子上将形成切口，且Mg 2+存在时，两条链上的切口独立无关，Mn2+存在时，两条链上的切口几乎在同一位置

  36. 2. 用途 1) 切口移位，制备DNA探针 2) 制备RNA样品时除去DNA分子 3) 基因突变时产生切口 4)使用DNase I足迹法测定DNA结合蛋白在DNA上的精确结合位点 DNaseI HO P DNaseI与 Pol I 的 切口移位 5′ 3′ Pol I 5′ 3′ 5′ 3′

  37. 缺口平移（nick translation）技术

  38. （三）S1核酸酶 （三）S1核酸酶 来源于米曲霉菌，是一种含锌蛋白质，相对耐热。 反应条件：Zn 2+和酸性条件(PH4.0-4.5). 作用: ①切掉DNA片段单链突出末段产生平头末段。 ② 切除双链中的发夹结构。 ③S1核酸酶作图： 测定杂交程度、RNA分子定位、内含子的位子、内含子和外显子剪切位点的定位、转录起始位点和终止位点的测定。（课本32、33页图）

  39. （三）S1核酸酶

  40. S1核酸酶

  41. S1核酸酶

  42. S1核酸酶

  43. （四）外切酶III（ExoIII） 1. 一般特点：来自于E.coli，分子量28,000 kD 2. 催化反应类型 1) 外切酶活性：3′→5′，产生5′-单磷酸核苷酸和具各种结构的 ds-DNA，pH 7.6-8.5 2) 核酸酶H活性：除去DNA-RNA杂交分子中的RNA分子，pH 7.6-8.5 3) 3′-磷酸酶活性：除去3′-磷酸基后形成3′-OH端，有利于DNA聚合酶反应，pH 6.8-7.4 4) 内切酶活性：在无嘌呤或无嘧啶处将DNA键切开，pH 7.6-8.5

  44. 核酸外切酶活性 • 3′→5′外切酶活性 • 5′→3′外切酶活性

  45. 核酸酶

  46. 3.外切酶活性特点 1) 反应底物：互补ds-DNA 2) 碱基释放速度：C>>A-T>>G 3) 反应产物：5′-单磷酸核苷和具缺口或5′-端突起的ds-DNA，过度反应将导致DNA降解 4.用途 1)核酸（DNA）标记 2)基因突变----缺失 3)DNA序列测定时作顺序缺失 5.使用注意事项 1)正式使用前，测定在一定条件下酶的反应速度 2)在一定条件下，ExoIII不能作用GC富集区(来自于cDNA加尾)

  47. OH3' OH3' 5'P 5'P 3'HO P5' P5' 3'HO 5'P OH3' 5'P OH3' P5' 3'HO 3'HO P5' 3'HO P5' 3'HO 5'P 3'HO OH3' P5' P5' RNaseH P5' 3'HO P5' 3'HO ExoIII的外切酶和RNaseH的作用

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