Ruolo dei geni KNOX di M. truncatula nell’organogenesi dei noduli radicali indotta dai rizobi

Consiglio Nazionale delle Ricerche Ruolo dei geni KNOX di M. truncatulanell’organogenesi dei noduli radicali indotta dai rizobi Candidato: Francesca Sciarra Relatore interno: Prof.ssa Paola Vittorioso Relatore esterno: Dott.ssa Giovanna Frugis Facoltà di Scienze, Matematiche, Fisiche e Naturali Corso di laurea in Biologia e Tecnologie cellulari Cattedra di Biologia molecolare

I fattori di trascrizione TALE

I TALEsono suddivisi in due famiglie: i KNOX e i BELL/BLH

Funzione dei TALEnella determinazione dei confini tra zone indifferenziate e organi in formazione Long and Barton, 1996

Medicago truncatula come sistema modello

Formazione del nodulo simbiotico e importanza del segnale di trasduzione delle citochinine Dato il coinvolgimento dei KNOX nei processi morfogenetici alla base della formazione degli organi, ci siamo chiesti se l'espressione degli MtKNOX in radice potesse sottendere un ruolo nell'organogenesi del nodulo e se questa funzione possa essere mediata dalle citochinine

Scopo della tesi Identificazione e caratterizzazione dei geni KNOX di Medicagotruncatula coinvolti nella formazione del nodulo simbiotico Sviluppo sperimentale • Analisi dei geni KNOX presenti nel genoma di M. truncatula • Analisi in silicoper identificare i geni coinvolti nel processo • Validazione sperimentale dei dati ottenuti in silico • Esperimenti di induzione con citochinine per identificare i geni KNOX indotti dall’ormone • Rielaborazione di dati pubblici di trascrittomica per analisi di “digital in situ” • Analisi funzionali mediante esperimenti di sovraespressione e silenziamento genico (RNAi)

Geni KNOX presenti nel genoma di M. truncatula class 1 class M class 2

Identificazione “in silico” dei geni KNOX espressi durante l’organogenesi del nodulo simbiotico classe 1 classe M Espressione relativa Espressione relativa classe 2 classe 1 classe M Espressione relativa KNAT3/4-like classe 2

Validazione sperimentale dell’analisi “in silico“ mediante qRT-PCR * Espressione relativa * * * * * Espressione relativa Espressione relativa

Regolazione trascrizionale dei geni KNOX identificati in risposta a citochinine * * Espressione relativa * * * * * Espressione relativa *

Rielabolazione dei dati di trascrittomica per analisi di “digital in situ” Fattore di arricchimento meristem distal infection zone proximal infection zone Log2 valore medio di espressione infected cells infection zone uninfected cells

Preparazione di costrutti per il silenziamento multiplo dei geni MtKNOX3-like N-term C-term KNOX1 KNOX2 GSE ELK HOMEODOMAIN MEINOX domain ELK KNOX2 HOMEODOMAIN

Analisi funzionale dei geni MtKNOX3-like: costrutti e omologie di sequenza dei frammenti utilizzati per l’RNAi

Analisi funzionale dei geni MtKNOX3-like: espressione genica in radici di “composite plants” * Espressione media normalizzata * * * Espressione relativa Espressione relativa * * * * * * * * *

Analisi funzionali dei geni MtKNOX3-like: fenotipi ottenuti da radici di “composite plants” inoculate con rizobio Sm1021 Vettore vuoto pFRN MtKNOX3 KNOXII RNAi pFRN MtKNOX3 KNOXII RNAi Noduli fusi Noduli fusi

Conclusioni • Sono stati identificati tutti i geni KNOX presenti nel genoma di M. truncatula • Abbiamo identificato tre KNOX, appartenenti al gruppo KNAT3/4-like della classe 2 (MtKNOX3-like), che sono indotti durante il processo di morfogenesi del nodulo simbiotico • Due MtKNOX3-like sono indotti da citochinine in maniera dipendente dal recettore CRE1 • I geni MtKNOX3-like sono altamente omologhi e coespressi in specifiche regioni del nodulo, suggerendo funzioni ridondanti • Studi funzionali di nodulazione su radici trasformate mediante A. rhizogenes (“composite plants”) indicano una funzione di questi geni nel posizionamento e nello sviluppo del nodulo

Prospettive future • Verranno trasferiti i costrutti di overespressione e RNAi all’interno del vettore pFRN al fine di migliorare l’efficienza di trasformazione delle radici • Verranno effettuate ulteriori analisi molecolari per identificare i geni regolati dai fattori MtKNOX durante il processo di nodulazione e il loro coinvolgimento nel segnale di trasduzione delle citochinine • Verranno effettuate analisi istologiche per caratterizzare il fenotipo di nodulazione derivante dal silenziamento di MtKNOX3 e dei suoi omologhi • Verranno effettuati studi per identificare le proteine che interagiscono con i fattori KNOX durante il processo di nodulazione

Ruolo dei geni KNOX di M. truncatula nell’organogenesi dei noduli radicali indotta dai rizobi