柞蚕分子系统学研究

1. 柞蚕分子系统学研究

2. 引言 • 分子系统学(molecular systematics)是近40年发展起来的应用生物化学及分子生物学技术解决进化生物学问题的一门综合性很强的交叉学科，是检测、描述并解释生物在分子水平的多样性及其演化规律的学科。 • 分子系统学研究的主要内容包括群体遗传结构、分类学、系统发育和分子进化。 • 分子系统学研究的方法有两种，分别是分子标记技术（间接方法）和序列测定（直接方法）。分子标记技术包括RFLP、SSR、RAPD、AFLP、EST、FISSR-PCR、SNP、全基因组微列阵芯片等。每种分析技术都有各自的优缺点，选择哪一种主要依赖于研究的目的。

3. 1.家养动物（包括蚕类昆虫）的起源和进化研究具有重要的科学意义和应用价值1.家养动物（包括蚕类昆虫）的起源和进化研究具有重要的科学意义和应用价值 • 家养动物(包括昆虫)的遗传分化与遗传多样性一直是生命科学领域的基础理论问题，也是关注的热点问题。 • 在强烈的人工选择作用下，家养动物呈现出丰富的形态变异，远超过了其野生祖先或野生近缘种。这为研究选择的作用及形态变异的发育遗传基础提供了绝佳的材料。 • 家养动物的遗传多样性在某种意义上也是宝贵的遗传资源，对其的了解不但是现代遗传育种的物质基础，也是为了人类未来需求变化培育新品种作准备。 • 了解家养动物品种多样性的起源与形成过程, 将有助于合理保护和持续利用品种资源。此外, 阐明起源问题, 也是进一步开展人工选择作用对家养动物遗传与进化影响的重要基础。

4. 2.柞蚕在研究起源分化与遗传多样性形成等方面具有自己的特色与优势，是一个很好的材料2.柞蚕在研究起源分化与遗传多样性形成等方面具有自己的特色与优势，是一个很好的材料 相对于历史悠久、品种（或种群）多样性极其丰富，但起源地不清楚、分化时间不明的家蚕、果蝇等模式生物来说，柞蚕具有自己的特色与优势。 • 第一、柞蚕的起源地和祖先来源清楚。 • 第二、柞蚕不同地理种群（原始地方品种）的扩散时间清楚、分化时间较短。 • 第三、地方品种的原始遗传结构保存良好。 • 第四、品种多样性中等丰富，而且形态分化明显。 • 第五、柞蚕是我国的特色产业，也是中国生物多样性的关键昆虫类群之一 。

5. 第一、柞蚕的起源地和祖先来源清楚：柞蚕是我国特有属种之一，起源于我国的山东省鲁中南地区，是由野生柞蚕驯化而来。第一、柞蚕的起源地和祖先来源清楚：柞蚕是我国特有属种之一，起源于我国的山东省鲁中南地区，是由野生柞蚕驯化而来。 关于柞蚕的起源历史有详细的文献记载[5-7]。柞蚕人工放养的记载始于清代，代表作品有《山蚕说》（孙廷铨，1651）、《蒙阴》（张纲孙，1651）。 野生柞蚕的发现是柞蚕起源于我国的实物证据。有河南的“嵩县野柞蚕”（1956）、“信阳野柞蚕”（1960，1993）、“台湾野柞蚕”（20世纪80年代），“贵州野柞蚕”（2001）。

6. 第二、柞蚕不同地理种群（原始地方品种）的扩散时间清楚、分化时间较短：从17世纪中叶开始，柞蚕种在人类的经济活动推动下从山东逐渐向四周扩散。第二、柞蚕不同地理种群（原始地方品种）的扩散时间清楚、分化时间较短：从17世纪中叶开始，柞蚕种在人类的经济活动推动下从山东逐渐向四周扩散。 • 柞蚕种在山东省鲁中南地区出现后，经长期驯化，山东人民培育出了客岭种、胶州种等柞蚕种。 • 1744年，山东人到河南放养柞蚕已经获得成功。河南柞蚕业兴起后，形成了自己的地方性品种——鲁山种。 • 1741年，贵州遵义知府陈玉玺从山东引种获得成功。培育了贵州柞蚕种——湄潭种。 • 17世纪末或18世纪初，山东蚕民到辽宁南部地区放养柞蚕并由此兴起。以后，辽宁形成了自己的青黄种。 • 1911~1931年，山东、辽宁人携带柞蚕种到吉林放养。

7. 柞蚕的起源与传播（引自《中国柞蚕品种志》，1995）柞蚕的起源与传播（引自《中国柞蚕品种志》，1995）

8. 第三、地方品种的原始遗传结构保存良好：20世纪50年代我国才开始收集农家种选育柞蚕新品种，而且柞蚕品种的纯度仍较低。第三、地方品种的原始遗传结构保存良好：20世纪50年代我国才开始收集农家种选育柞蚕新品种，而且柞蚕品种的纯度仍较低。 20世纪50年代，我国才开始收集农家种选育柞蚕新品种。1954年，辽宁蚕业研究所由农家青黄种中育成了我国第一个柞蚕新品种青黄1号，以后选育成青6号、克青、水青、宽青、清河1号。山东从较原始的客青种群中选育了胶蓝，从辽东的青黄种整理出黄安东。河南选育出豫早1号、河41、33、39、鲁松。贵州选育成101、125、128、130等。吉林从辽东农家青黄种育成“小黄皮”。 这些品种均是通过混合选择或系统分离的方法培育的，强调自然选择的作用，蚕品种难以达到较高的纯度，也保持了柞蚕种的原始遗传结构，为研究品种的遗传分化和多样性形成提供了非常好的材料。

9. 第四、品种多样性中等丰富，而且形态分化明显：我国现有100多个柞蚕品种，并且在形态上已经有巨大差异。第四、品种多样性中等丰富，而且形态分化明显：我国现有100多个柞蚕品种，并且在形态上已经有巨大差异。 这100多个柞蚕品种成为现代柞蚕业发展的基础和资源开发利用的丰富宝库。这些品种在体色上有青黄蚕、黄蚕、蓝蚕和白蚕，在化性上有1化和2化，以及分布在不同的生态区域等。 这些品种之间的遗传背景如何，遗传学上的分化如何（经过近400年的选择其群体间的遗传分化达到了什么程度），每一地理种群和品种的遗传多样性又如何，这些问题都需要进行研究。

10. 青黄蚕 黄蚕 红蚕 青蚕 青黄蚕 黄蚕 白蚕 蓝蚕 柞蚕的体色分化

11. 2化性区 化性不稳定区 1化性区 柞蚕的化性分化

12. 辽宁区，中温带季风气候区 山东区，中温带—暖温带气候区 河南区，暖温带—亚热带，湿润—半湿润气候区 贵州区，暖温带—亚热带湿润气候区 柞蚕的生态分布

13. 第五、柞蚕是我国的特色产业，也是中国生物多样性的关键昆虫类群之一。第五、柞蚕是我国的特色产业，也是中国生物多样性的关键昆虫类群之一。 在中国生物多样性的关键类群（陈灵芝，1993）中，柞蚕被列为昆虫的关键类群之一，属于急需加强分子水平上的遗传分化与遗传多样性研究的目标类群之一。

14. 3.柞蚕遗传学基础研究的现状及其分析 自柞蚕学科成立以来，从事柞蚕遗传学研究的人员就很少，现有的柞蚕遗传学研究报道也很零散，而且，这些很少的资料也主要集中在表型和生理生化水平，如形态形状（刚毛、体色）、经济性状、滞育和化性、饲料效率、代谢酶活性与经济性状的关系等方面。 20世纪90年代，本试验室刘治国教授开展了形态、数量性状、生化遗传研究，以后开展了同工酶及代谢酶活性与柞蚕杂种优势关系研究，自2000年开始本实验室开始利用RAPD标记开展柞蚕遗传分化与遗传多样性研究。 与家养动物起源分化与遗传多样性研究已进入基因组学水平相比，柞蚕已经远远落后了。

15. 4.柞蚕起源分化与遗传多样性研究的具体意义 • 现实意义方面： 1）可以为最终建立所有柞蚕品种之间的遗传分化关系奠定基础，为育种提供理论依据。 2）可以提升柞蚕遗传学基础研究的水平，跟踪生命科学发展趋势， • 理论意义方面： 3）可为进一步探讨人工选择作用对柞蚕遗传与进化的影响以及柞蚕的适应性机制奠定基础。 4）在研究物种起源分化以及遗传多样性形成等方面也可以提供一些有益的补充和启示。

16. 5.柞蚕品种遗传结构的RAPD分析 • 具体问题：目前的柞蚕群体是否可以称为品种？ 国内外部分学者认为，目前的柞蚕品种尚不能称之为遗传上的“品种”，因为同一个“品种”内有形态上的差异，即尚没有形成真正的品种遗传结构。 答案：可以。

17. 5.柞蚕品种遗传结构的RAPD分析 • 品种的选择 a，现行分类系统；柞蚕为体色系统，家蚕为地理系统

18. 5.柞蚕品种遗传结构的RAPD分析 • 不管是种内还是品种内，柞蚕的DNA多态性均高于家蚕。

19. 5.柞蚕品种遗传结构的RAPD分析 • 柞蚕品种内个体间的遗传距离远大于家蚕，不同品种个体间的遗传距离与家蚕相似。

20. 5.柞蚕品种遗传结构的RAPD分析 • 虽然柞蚕个体间的DNA多态性较高，但已经可以称之为“品种”。 四青 河41 杏黄 青黄1号

21. 5.柞蚕品种遗传结构的RAPD分析 • 柞蚕的遗传变异主要来源于品种内，而不是品种间，表明目前的柞蚕品种仍是一个遗传多样性十分丰富的群体，纯度较低。

22. 柞蚕 家蚕 品种内的DNA多态性 48.2%（45.8%~49.4%） 15.5%（9.09%~19.7%） 品种内的遗传距离 0.133~0.238 0.008~0.081 遗传变异分布 品种间 < 品种内 品种间 > 品种内 5.柞蚕品种遗传结构的RAPD分析 • 柞蚕品种内的遗传多样性丰富、纯度较低，是与其起源驯化历史较短、野外生存的生态环境、混合选择的品种选育方法是相一致的。

23. 6. 4种体色柞蚕品种遗传关系的RAPD分析 • 具体问题：体色可以反映品种之间的遗传关系？ 目前，柞蚕品种的分类系统是根据五龄幼虫体色进行划分的，而且，在育种上也以此为依据，认为不同体色系统的品种之间的血缘关系较远，生理遗传差异较大，杂质优势表现明显。 答案：不能。

24. 6. 4种体色柞蚕品种遗传关系的RAPD分析

25. 6. 4种体色柞蚕品种遗传关系的RAPD分析 • 33个10bp 随机引物对13个品种共扩增出265条清晰DNA条带，其中227条（85.66%）呈多态性。 • 没有发现同一体色品种特有带。 • 同一体色品种的遗传距离并不比不同体色品种的小。黄蚕品种间（5个）的平均遗传距离为0.309（0.267~ 0.393），青黄蚕品种间（6个）的平均遗传距离为0.305（0.248~0.341），黄蚕与青黄蚕品种之间的平均遗传距离为0.302（0.226~0.374）。

26. 6. 4种体色柞蚕品种遗传关系的RAPD分析 • 品种间基于RAPD标记的聚类与幼虫体色之间并没有相关性。这是首次在分子水平上得到的柞蚕体色与类群划分之间没有相关性的证据。

27. 7. 基于RAPD标记的柞蚕品种资源的亲缘关系 • 具体问题：柞蚕品种应该如何进行类群划分？ 目前，柞蚕品种的分类系统是根据五龄幼虫体色进行划分的，而且，在育种上也以此为依据。但是，前面的研究表明体色并不能作为类群划分的依据。 答案：体色和化性均不行;可以按产地（品种育成地）划分。

28. 7. 基于RAPD标记的柞蚕品种资源的亲缘关系 样品： 68个柞蚕品种（系），超过我国现有品种资源的半数。 4种体色：黄蚕、青黄蚕、白蚕、蓝蚕 3种化性：1化性、2化性、2化地区的1化性品种 7个产地：山东、辽宁、河南、贵州、吉林、内蒙古、朝鲜 2个外群：天蚕，家蚕C108 4个个体/品种，分别DNA组成“基因池”进行PCR分析。

29. 7. 基于RAPD标记的柞蚕品种资源的亲缘关系 • 从120个10bp 随机引物中选择了33个多态性和重复性好的。 • 33个引物对70个样品共扩增出364条清晰DNA条带，其中360条（98.90%）呈多态性。 • 68个柞蚕品种共扩增出296条带，多态性带占90.99%。 • 大多数柞蚕品种的扩增带数在130~160条之间，最少的“33”有104条带，最多的“青绿”有171条带。 • 68个品种（系）中只有9个品种产生了特有带，仅占12.68%。

30. 7. 基于RAPD标记的柞蚕品种资源的亲缘关系 • 柞蚕品种资源之间的遗传距离较小，亲缘关系较近。这与其驯化历史较短、分化程度较低是一致的。

31. I II III IV V VI 364个RAPD位点，单匹配相似系数计算遗传距离，NJ法重建系统发生树。该聚类树为较优树，因为与柞蚕品种的传播以及生物学特性有较好的相合性。

32. 类群 品种（系）数 品种（系） 特性 I 23 柞早1号、701、多丝4号、371、三里丝、抗病2号、白茧825、辽柞1号、64、多丝2号、多丝3号、小杏黄； 宽青、黄安东、海青、白茧1号、扎兰2号、黑蛾、78-6、扎兰3号、青绿； 鲁黄、松黄 9个辽宁的2化性品种，2个吉林的2化性品种，1个朝鲜的2化性品种； 均为2化性品种，来源于辽宁、内蒙古、山东；  培育1化性品种 II 19 豫101、豫早1号； 豫早3号、豫早2号、小黄皮、河41、豫6号； 78-3、79-4、6406、小白蚕、104、101、133、125、103、128、130、102 河南的1化性品种； 4个河南的1化性品种和1个吉林的2化性品种； 11个贵州的1化性品种，1个辽宁的2化性品种 III 3 882、沈农青蚕、沈黄1号 2化品种，均来源于辽宁 IV 6 清河1号、四青、青皮、吉黄1化、定州1号、33 1化和2化品种各3各；分别来源于辽宁、吉林、河南和朝鲜 V 14 水青、鲁红、胶蓝、杏黄、青6号、方山黄1号（A、B）、烟6号（3、4）、方山黄、789（5、10）、方山黄2号（901、902） 均为2化性；3个品种（系）来源辽宁，11个品种（系）来源于山东 VI 3 辽青、扎兰1号、青黄1号 来源于辽宁和内蒙古

33. 7. 基于RAPD标记的柞蚕品种资源的亲缘关系 • 进一步证实了柞蚕品种的聚类与体色并没有一定的相关性 。 • 依据化性进行柞蚕品种的分类也是比较粗糙的，其不能将化性相同的品种的差异反映出来。 • 可以初步将现有柞蚕品种资源大致划分为3个大的类群，即山东类群、辽宁类群（包括辽宁、吉林、内蒙古和朝鲜的品种）和河南类群（包括河南和贵州的品种）。

34. 7. 基于RAPD标记的柞蚕品种资源的亲缘关系 • 地域性聚类明显：除极个别品种外，柞蚕的品种按地域分布聚在一起，即柞蚕品种的遗传聚类与其目前的地理分布有密切的相关性。 • 与家蚕的地理系统聚类结果仅在表面上相似，而实质上不同：柞蚕的绝大多数品种是按目前所在的地域聚类的，与品种的原始产地关系不明显；而家蚕却主要是按品种的原始产地聚类的，与品种的现保存地域无关。 • 柞蚕是野外放养的昆虫，其生长发育过程中受自然环境条件的影响甚大，并且自然环境条件对柞蚕的影响可能远大于其所受的人工选择的影响，在各地较强的自然选择压力下，品种在适应的过程中逐渐形成了某些地域性的特性，在聚类中即反映出地域性的特点。

35. 8. 柞蚕不同群体间的遗传分化 • 具体问题：既然柞蚕品种应该按地域划分类群，那这些地理群体之间的遗传分化程度究竟如何？ 如按照体色和化性进行类群划分呢？ 答案：地理群体之间的遗传分化达到20.84%。

36. 8.柞蚕不同群体间的遗传分化 “0、1”数据处理 体色群体：不包括白蚕和蓝蚕，66个样品分成青黄蚕群体和黄蚕群体。 化性群体：68个样品分为1化性群体、2化性群体和培育1化性群体（2化地区培育的1化性品种）。 地理群体：将一地目前分布的所有品种均认为其属于同一地理群体，并根据系统聚类结果将辽宁的品种分成2个群体。因此，68个样品共分为8个群体，即辽宁1、辽宁2、山东、贵州、河南、吉林、内蒙古、朝鲜。 软件：PopGen（Yeh，1997），包括Shannon信息指数、 Nei基因多样性指数、基因流Nm

37. 8.柞蚕不同群体间的遗传分化 • 体色类群之间的遗传分化系数仅为3.83%/2.88%。

38. 8.柞蚕不同群体间的遗传分化 • 化性类群之间的遗传分化系数达到为16.55%/10.40%。

39. 8.柞蚕不同群体间的遗传分化 • 地理类群间遗传分化系数最大，达到为26.18%/20.84%。但是，柞蚕的遗传变异仍主要存在于群体内。

40. 8.柞蚕不同群体间的遗传分化 • 群体间具有高度的遗传一致度。

41. 8.柞蚕不同群体间的遗传分化 • 聚类结果与地理空间距离相关性不大。

42. 9.柞蚕线粒体基因组全序列的测定与分析 • 具体问题：柞蚕线粒体基因组有何结构特征？ 有关线粒体基因组的研究对生物学的重大课题如生命的成因、起源和进化、基因组信息、基因结构与功能等的探索极其重要。进行柞蚕线粒体基因组研究不仅可以丰富线粒体基因组数据库，为线粒体基因组的比较研究提供基本数据。

43. 9.柞蚕线粒体基因组全序列的测定与分析 • 柞蚕（早1 ；AY242996）的环状mtDNA全长15566 bp，包含13个蛋白质编码基因、22个 tRNA基因、2个rRNA基因和1个控制区（AT富集区/552bp）。

44. 9.柞蚕线粒体基因组全序列的测定与分析 • 全基因组的AT含量为80.2%。在目前已知的8个鳞翅目昆虫线粒体基因组中最低。 • 使用T的频率稍微高于A，在AT富集区表现更突出。

45. 9.柞蚕线粒体基因组全序列的测定与分析 • 蛋白编码基因的起始子均是ATN（ATA/2、ATT/4、 ATG/6），除了COI（TTAG）。 • 终止子有3种：TAA/8、TA-tRNA/1、T-tRNA/4。

46. 9.柞蚕线粒体基因组全序列的测定与分析 • 所有tRNA基因均能形成稳定的三叶草构（ canonical clover-leaf），除了tRNASer(AGN)。 tRNASer（UCN） tRNASer（AGN）

47. 9.柞蚕线粒体基因组全序列的测定与分析 • 密码子使用有严重的偏好性。最常用的氨基酸是Leucine (15.02%)、isoleucine (11.90%)、 phenylalanine (10.69%)和serine (8.75%)。

48. 9.柞蚕线粒体基因组全序列的测定与分析 • 富含AT的6个密码子Asn (N)、Ile (I) 、Lys (K)、Met (M)、Phe (F)、Tyr (Y)的使用频率为1630 次 ( 43.8 %)，而富含GC的4个密码子Ala(A)、Arg(R)、Gly(G)、Pro(P) 共出现 510次 (13.7%)。 • 富含GC密码子/富含AT密码子=0.31。结果与鳞翅目中的B. mori (0.28)、O. nubilalis (0.29)、O. furnicalis (0.30)、A. honmai (0.31)非常相似， 但均低于双翅目昆虫（0.42~0.43）。

49. 9.柞蚕线粒体基因组全序列的测定与分析 • 除了AT富集区外的非编码区总计202 bp，分布在18个区域，长度在1~56 bp之间。最长的非编码区长56 bp（AT%=92.9%），位于tRNAGln和ND2之间。 • 重叠序列只有19 bp，分布在4个区域（1~8 bp）。

50. 9.柞蚕线粒体基因组全序列的测定与分析 • AT富集区长552bp，位于srRNA和tRNAMet之间。 53bp 38bp 278bp have two conserved sequence blocks (~55bp)with B. mori and mandarina T19 ATTTAATATACAAGATTTTTCTTACTATTATATTAAAT inverted repeats core motif inverted repeats