Polymorfismus

1. Polymorfismus lidské DNA

2. Genetický polymorfismus • Vylučuje: negenetické znaky, kontinuitní variabilitu, polytypismy, zřídkavé znaky (dědičné choroby) • Typy polymorfismů: • morfologický • funkční • serologický • biochemický • DNA: je nejčastejší, protože většina polymorfismů DNA nemá fenotypový projev • Definice (Ford): Geneticky podminěný znak s nejméně dvěma diskontinuitními variantami • v jedné populaci, přičemž četnost zřídkavější varianty je vyšší než 1%

3. Typy DNA polymorfismů • Bodový polymorfismus (substituce jednotlivých bází; SNP) • Variabilní počet tandem. repeticí • mikrosatelity (STR) • minisatelity (VNTR) • makrosatelity • Přítomnost/nepřítomnost sekvence (Alu, L1 a i.) na specifickém místě (indel)

4. Bodový polymorfismus (Single Nucleotide Polymorphism, SNP) ▼MspI▼MspI ▼MspI 5´-... A C C G G T A C A ... A T C C G G T T A G C C G G T A ...-3´ ▼ MspI X ▼ MspI 5´- ...A C C G G T A T A ... A T C A G G T T A G C C G G T A ...-3´ I...~1000 bp ...I • Četnost odlišností: cca 1 : 1000 bp; v genomu cca 30 mil. SNP, t.č. registrovaných více než 10 mil. (2004), ale jen část je definitivně potvrzených; • Výskyt: introny, nekódující oblasti (většinou žádný fenotyp); jen asi 50 000 v kódujících sekvencích genů • Vznik: mutace + genetický drift (někdy selekce); neznáme původní stav, jen nepřímo (ze sekvence u primátů); • nejčastěji v dinukl. CpG • Možný důsledek: přítomnost/nepřítomnost restrikč. místa (v rozpozn. sekvenci RE, asi 20%): vznik RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

5. Detekce SNP polymorfismu • RFLP (restriction fragment lenght polymorphism) - restrikční štěpení genomické DNA s následným Southern blottingem (dny) - PCR amplifikace s následným restrikčním štěpením (den) • DNA array (čipy) analýza až 100 tisíc SNP v jedné analýze sonda

6. ....(TGAC)(TGAC)(TGAC)....... ....(TGAC)(TGAC)(TGAC)(TGAC)(TGAC)......... Detekce PCR amplifikací repetitívního úseku a separací na gelu: Polymorfismus variabilního počtu tandemových opakování (VNTR, STR)

7. Polymorfismus variabilního počtu tandemových repeticí Mikrosatelity (STR) • Délka základní repetície 2 - 6bp • Počet opakování repetice 2 – 100 • Výskyt rovnoměrněv genomu • Odhadovaný počet řádově 105 • Jednoduchá detekce: PCR • Vznik nových alel: replikační chyby • Mutační frekvence: cca 10-3 • Využití: rozsáhlé; individuální identifikace, nepřímá DNA diagnostika, identifikace génů • Biologický význam: neznámý • Výjímka: expanze trinukleotidů u některých chorob • Najčastejší: „CA-repeat“ (asi 50 000 x v genomu) Minisatelity (VNTR) • Délka základní repetice >6bp • Počet opakování repetice 10 – 100 (1000) • Výskyt preferenčně v telomerických oblastech ( bohaté na GC páry) • Odhadovaný počet: cca 104 • Jednoduchá detekce: Southern, PCR • Vznik nových alel: nehomologický crossover • Mutační frekvence: vysoká, až 10-3 • Využití: omezené; individuální identifikace • Biologický význam: neznámý • Spec. případ: minisatelit (TTAGGG)n - telomery

8. Typy mikrosatelitů Typy: • Perfektní (jednoduché) (CA)n • Imperfektní (CA)n TTT (CA)m • Složené (CA)n AAA (AT)m V genomu: (CA)n - 0,5% (nejméně 50 000) (TC)n – 0,2% ostatní dinukl. – skoro 0% tri- a tetra: zřídkavé, ale najčastěji používané v praxi

9. Inzerčno-deleční polymorfizmus (indel) • Indel od 1 bp po několik Mb • inzerce Alu, L1 – retrotranspozice • Velmi zřídkavý jev: inzerce jsou unikátní události • Známe původní stav (bez inzerce) • Inzerce (Alu, L1) také do kódujúcích sekvencí → patologie inzerčně-deleční polymorfismus Alu-sekvence (300 bp) v Y-chrom. DNA:

10. Využití polymorfismů DNA • Identifikace osob/vzorek DNA (A. Jeffreys 1985) • Určování paternity (VNTR, STR) • Nepřímá dg. monogénních chorob • Hledání nových genů (poziční klonování genů) • SNP a multifaktoriálníchoroby?

11. Individuální identifikace „DNA fingerprint“ • Alec Jeffreys, 1984 • Restrikční štěpení genomické DNA → elektroforetická separace → Southern blotting s VNTR sondou (GGGCAGGAXG)

12. PCR amplifikace VNTR polymorfismu • amplifikace konkrétního polymorfismu/lokusu pomocí specifických primerů( leží mimo repetice) + elektroforéza primery

13. Multiplex PCR • Amplifikace více lokusů v jedné PCR reakci vlevo - separace na akrylamidovém gelu a vizualizace stříbrem vpravo - fluorescenční značení primerů a kapilárová elektroforéza

14. Mikrosatelity: variabilita v populacii • Genotypy třech lidí v čtyřech STR polymorfismech (fluorescenční značení a kapilárová elektroforéza) D8S1179 D21S11 D7S820 CSF1PO Jedinci 1. 2. 3.

15. Identifikace osob • Multiplex PCR 16 fluorescenčně značných mikrosatelitových polymorfismů • Pravděpodobnost identity dvou náhodných jedinců 10-17

16. Polymorfismus mtDNA Polymorfismy mtDNA: • Mimo D-kličky 10x častější než v gDNA • V rámci D-kličky až 100x častější než v gDNA • Žádná rekombinace: haplotypy; haploskupiny • Matrilineární dědičnost • Využití: studium evoluce lidských populací

17. Přenos mtDNA, Y-chromozální DNA a autozomální DNA mtDNA a Y-DNA: žádná rekombinace Před 5 generacemi měl každý jedinec 25 = 32 předků, z nich jen od jednoho zdědil Y, od jednoho mtDNA, ale od každého část autozomální DNA přenos „en bloc“ přes generace Každý má právě jednoho Y-předka a jednoho mt předka v kterékoliv předešlé generaci Matka Otec Dítě

18. Koalescence linií mtDNA a Y-DNA„mitochondriální Eva“ • Možné najít společného předka pro členy populace, protože • v každé generaci dojde k zániku a naopak k zmnožení některých linií, • a po čase v rovnovážné populacii převládne mt/Y DNA odvozené od jednoho spoločného předka

19. Polymorfní haplotypy • Haplotyp: soubor alel na jednom chromozomu, které se jen zřídka oddělí rekombinací • Haplotypové bloky v lidském genomu: rekombinační „cold spots“ • Využití: studium „věku“ mutací