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第四章 分子生物学常用技术. Ⅰ. 核酸分子杂交（ DNA/DNA or DNA/RNA ）技术 核酸分子杂交技术，是在 1968 年由华盛顿卡内基学院（ Cavnegie Institute of Washington ）的 Roy Britten 及其同事发明的。所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链 DNA 或 RNA ，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。. 1 、萨瑟恩 DNA 印迹杂交
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Ⅰ.核酸分子杂交（DNA/DNA or DNA/RNA）技术 核酸分子杂交技术，是在1968年由华盛顿卡内基学院（Cavnegie Institute of Washington）的Roy Britten及其同事发明的。所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。
1、萨瑟恩DNA印迹杂交 根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或 RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。由于它是由E.Southern于1975年首先设计出来的，故又叫Southern DNA 印迹转移技术。
（a） 基因组DNA DNA限制片段 （b） （c） （d） 硝酸纤维素滤膜 同探针同源杂交的基因DNA片段 （e） X光底片 Southern 凝胶转移杂交技术
Southern DNA 印迹杂交之X光显像图片 水稻（Oryza sativa L.)的叶绿体DNA分别用核酸内切限制酶BglⅡ(A-C)、BamHⅠ（D-F）、EcoRⅠ（G-I）、和HindⅢ（J-L）消化，加样在含有EtBr染料的1%的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同32P标记的玉米psbA探针作Southern杂交。X光底片中显现的阳性条带 ，表明含有水稻的psbA基因序列。
2、诺赛恩RNA印迹技术（Northern blotting） 1979年，J.C.Alwine等人发展而来，是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与萨瑟恩DNA印迹杂交技术十分类似，所以叫做诺赛恩RNA印迹技术（Northern blotting）。 而将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上，然后同放射性同位素125I标记的特定蛋白质之抗体进行反应，这种技术叫做韦斯顿蛋白质杂交技术（Western blotting）。
3、斑点印迹杂交和狭线印迹杂交 斑点印迹杂交（dot blotting）和狭线印迹杂交（slot blotting ）是在Southern印迹杂交的基础上发展的量种类式的快速检测特定核酸（DNA和RNA）分子的核酸杂交技术。由于在实验的加样过程中使用了特殊设计的加样装置，使众多待测样品能够一次同步转移到杂交滤膜上，并有规律地排列成点阵或线阵。这两项技术更适应与核酸样品的定量检测。
4、菌落杂交 检测重组体克隆的菌落杂交技术
1、凝胶阻滞实验（Gel retardation assay） 又叫DNA迁移率变动实验（DNA mobility shift assay），是在80年代初期出现的用于在体外研究DNA与蛋白质型胡作用的一种特殊的凝胶电泳技术。它具有简单、快捷等优点，也是当前被选作分离纯化特定DNA结合蛋白质的一种典型的实验方法。
* B * A C 放射性标记的DNA 细胞蛋白质提取物 * * 蛋白质与DNA结合 凝胶电泳 B * DNA-蛋白质结合物电泳迁移缓慢 * * * * * 放射自显影 滞后带表明DNA与蛋白质结合 凝胶阻滞实验的基本原理图 放射性标记的DNA由于同一种细胞蛋白质B结合，于是在凝胶电泳中移动速度变慢，在放射自显影中呈现滞后的条带
(a) (b) (c) * * * * * * 蛋白质与标记的探针DNA结合 蛋白质与未标记的竞争DNA结合 * * * * 凝胶电泳 * * * * * * * * * * 放射自显影 在凝胶阻滞实验中竞争DNA与探针DNA之间的竞争作用 （a）没有加入竞争DNA的正常的凝胶阻滞实验，探针DNA与特异蛋白质结合，出现阻滞条带；（b）加入的超量竞争DNA与探针DNA竞争结合同一种蛋白质，阻滞条带消失；（c）竞争DNA与探针DNA分别结合不同的蛋白质，出现同（a）一样的阻滞条带。
2、DNaseⅠ足迹实验（footprinting assay） 是一类用于检测与特定蛋白质结合的DNA序列的部位及特性的专门的实验技术。足迹实验的一个明显优点是，可以形象地展示出一种特殊的蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合区域。如果使用较大的DNA片段，通过足迹实验便可确定其中不同的核苷酸序列与不同蛋白质因子之间的结合单位的分布状况。如同凝胶阻滞实验一样，我们也可以加入非标记的竞争DNA序列，来消除特定的“足迹”，并据此测定其核苷酸序列的特异性。
1 5 10 32p (a) * 加入蛋白质X 1 4 8 10 * (b) 加入DNaseI凝胶电泳放射自显影 (c) 10 足迹 5 1 A B DNaseI 足迹实验
3、甲基化干扰实验（methyltion interference assay） 根据DMS（硫酸二甲酯）能够使G残基甲基化，而六氢吡啶又能够特异切割甲基化的G残基这一原理，设计出了另一种研究DNA与蛋白质相互作用的实验方法，即甲基化干扰实验。这种技术可以检测靶DNA中特异G残基的优先甲基化对而后的蛋白质结合作用究竟会有什么效应，从而更加详细地揭示DNA与蛋白质之间相互作用的模式。 DMS化学干扰的主要局限性时，它只能使G残基甲基化。尽管如此，它仍不愧为足迹实验的一种有效的补充手段，可以鉴定足迹区段中DNA与蛋白质相互作用的精确位置。 具体操作如下页图所示。
G G G G G G G DNA G G G G G G G G G G G G G G 局部甲基化 m m Ⅱ Ⅱ Ⅰ Ⅰ Ⅲ Ⅲ m m m m 与蛋白质提取物混合 与蛋白质结合 不与蛋白质结合 与蛋白质结合 凝胶电泳 与蛋白质结合的DNA带含有Ⅰ和Ⅲ两种类型DNA片段 切除所有结合与不结合蛋白质的DNA带，并用六氢吡啶切割甲基化的G残基 不能与蛋白质结合的DNA带含有全部三种类型DNA片段 结合带 非结合带 缺失的DNA带表明相应G残基的重要意义，它得到结合蛋白质的保护 甲基化干扰实验
4、体内足迹实验 完整的细胞 裸露的DNA × × G G G G G G DMS me Me Me G G 分离DNA并用六氢吡啶切割 PCR扩增 凝胶分析 受保护的G残基 应用甲基化保护作用进行的体内足迹实验
5、Southwestern杂交 6、Northwestern杂交
Ⅲ.PCR技术 1、基因扩增原理条件
靶DNA的扩增 5’ 3’ (a) 5’ 3’ (b) 引物2 3’ 5’ 引物1 引物2互补链 (c) 引物1互补链 3’ 5’ (d) 5’ 3’ 5’ 3’ (e) 3’ 5’ 新引物 不同长度的链 单位长度的链 (f) 引物1互补链 引物2互补链 目的片段（不同长度的链未示出） (g) 5’ 3’ 3’ 5’ 聚合酶链式反应示意图
循环1 循环2 循环3 温度（℃） 94℃变性（1min） 94 72 60 72 ℃延伸（1.5min） 60 ℃退火（1min） 时间（min） PCR反应的温度循环周期 PCR 反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是94℃变性1min， 60 ℃退火1min， 72 ℃延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。
Typical PCR Thermal Profile *This cycle is normally included in a PCR assay in order to allow any “unfinished” product from previous amplification to achieve its full length
靶DNA片段 2、PCR用于基因突变 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 引物A 引物A’ 3’ 5’ 5’ 3’ PCR PCR 引物B 引物C 混合,变性,退火 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ PCR PCR DNA聚合酶 用引物B和C作PCR 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ + 3’ 5’ PCR定点诱变
Ⅳ.体外转录与体外翻译 1、体外转录系统
2、常用的体外翻译系统 小麦胚、兔网织红血球 Ⅴ.基因瞬间表达与稳定表达 下节课讲
