Imunitní systém jako informační soustava

1. Imunitní systém jako informační soustava Cytokiny M.Průcha

2. Imunitní systém - úkoly • Zachování homeostázy • Zachování integrity makroorganismu • Rozpoznání cizího a vlastního

3. Imunitní systém - signální systém • Solubilní faktory – vysokomolekulární ( cytokiny, chemokiny, růstové faktory) - lipidové – eikosanoidy - nízkomolekulární - NO

4. Imunitní systém – signální systémy • Membránové interakce - receptory - adhezní molekuly - kostimulační molekuly - akcesorní molekuly

5. Hráči v přenosu signálu • Imunokompetentní buňky • Trombocyty, erytrocyty • Endotelové buňky • Epitelové buňky • Keratinocyty, fibroblasty • Buňky nervové a endokrinní soustavy • Molekuly mezibuněčné hmoty

10. Cytokiny - funkce • Aktivační signály, které se podílejí na buněčné aktivaci, regulaci buněčného cyklu • Autokrinní, parakrinní a systémové působení • Regulace exprese povrchových, kostimulačních a akcesorních molekul

11. Cytokiny - funkce • Změny buněčného cytoskeletu • Indukce apoptózy • Regulace zánětu • Regulace proliferace a diferenciace buněk imunitního systému

12. Cytokiny – receptory • 5 rodin receptorů pro cytokiny • Receptory pro hematopoetinové cytokiny • Receptory pro interferony α,β,γ a IL-10 • Receptory pro TNFα • Receptory pro IL-1, M-CSF a další • Transmembránový receptor – serpentinová molekula – vazba chemokinů

13. Cytokiny – nitrobuněčný přenos aktivačního signálu • Vazba ligandu na receptor –aktivace Janusových kináz(JAK – Janus Activated Kinase) – ty fysforylují receptorové podjednotky a umožňují vazbu cytoplasmatických molekul – STAT (Signal Transducers and AcTivators – ty přecházejí do jádra a váží se na regulační sekvence genů – to vede k přepisům genů, popř. k indukci buněčné proliferace a diferenciace

14. Caspase Cascade TNFR Fas Calcium Channel TNF RAIDD RAIDD FADD FADD TRADD TRADD TRADD Caspase1 Caspase9 Procaspase8 BAD Caspase8 Caspase8 tBID BID CIAP CIAP FasL Caspase3,6,7 SMAC/DIABLO TRAF2 RIP2 PAK1 JNK RICK NIK DNA-PK CytoC CytoC D4-GDI Perforin Perforin Activated Tissue Transglutaminase APAF1 Calpain NF-kB GranzymeB Caspase2 Caspase2 Caspase2 Caspase10 PARP Rb Caspase12 ICADCleaved Lamin-B2 Lamin-A Lamin-B1 Lamin-A 2009 ProteinLounge.com Sphingo-myelinase Daxx GRB GRB Kinase ICAD CAD CAD Ca2+ Ca2+ C ER Stress Ceramide CRMA Cell Survival CLEAVAGE OF DEATH SUBSTRATES Apoptosis DNAFragmentation Apoptosis

17. Regulace koncentrace cytokinů • Nutnost lokální regulace • Neutralizace vazbou na přirozené inhibitory (IL-1Ra) a solubilní formy receptorů • Vazba na makromolekuly buněčných povrchů a mezibuněčné hmoty • Uvolňování z lokálních rezervoárů (mezibuněčná hmota- matrixové metaloproteinázy, elastázy, aktivátory plasminogenu, heparanázy

18. Cytokiny – regulace koncentrace • Degradační enzymy rozloží mezibuněčnou hmotu a a umožní prostup buněk imunitního systému do tkání, kde pak uplatní svou vlastní produkci • DARC (Duff Antigen Receptor for Chemokines, CD234) na ery a endotelových bb. • Vazba CXC a CC chemokinů a odstranění z oběhu

19. Cytokiny - členění • Charakteristika na molekulové úrovni • Aminokyselinové složení a struktura, lokalizace genu odpovědného za produkci • Klonace genu • Zdroj cytokinů, buněčný substrát

20. Cytokiny - členění • Růstové faktory krvetvorby • Interferony I. a II. třídy • Interleukiny – stimulující hematopoezu, pluripotentní - prozánětlivé a regulující kooperaci Ta B lymfocytů, protizánětlivé • Chemokiny • Rodina TNFα • Rodina TNFβ

21. Cytokiny regulující krvetvorbu • STF (Stem Cell Factor) • IL-3 – produkovaný T ly a NK bb. (pluripotentní kolonie stimulující faktor) • Kolonie stimulující faktory (G-CSF, GM-CSF a M-CSF) • Klinické použití – léčba neutropenií po indukci cytostatickou léčbou

23. Interferony • Interferony I. typu – α,β,ω • Stimulátor – virová infekce • Antiproliferativní, cytostatický účinek • IFN α – leukocyty (chron.akt.hepatitida B, C, leukemie z vlasatých buněk • IFN β – léčba RS • IFN γ – Th ly , obrana – intracelulární parazité (M.tuberculosis)

25. Cytokiny regulující T a B lymfocytární systém • Heterogenní skupina • Prototypem je IL-2 • Th0, Th1 a Th2 subsety • Rozdílný profil produkovaných cytokinů • Th1 – buňkami zprostředkovaná specifická imunita • Th2 syntéza protilátek a diferenciace eosinofilů

26. Pluripotentní prozánětlivé cytokiny • IL – 6 a IL-1 • Produkce aktivovanými monocyto-makrofágovými bb IL- 1 – endogenní pyrogen Aktivace T ly Produkce RAF

29. Rodina tumor nekrotizujících faktorů • LPS jako podnět • Aktivace přes LBP a CD14 • Úloha v regulaci zánětu • Klinické aplikace –diagnostické • i terapeutické – inhibitory TNF

30. Transformující růstové faktory • TGFβ • Růstový aktivátor, růstový inhibitor • Chemoatraktant fibroblastů • Protizánětlivý účinek • Aktiviny a inhibiny

31. Chemokiny • M.h. < 10 000 • Regulace pohybu buněčných populací • Prozánětlivé účinky • Produkovány všemi jadernými buňkami • Stimulace endo i exogenně • Členění do skupin podle přítomnosti cysteinových zbytků • IL-8

32. Metody stanovení cytokinů • In vivo, ex vivo, in vitro • In vivo – uplatnění – septické stavy • Ex vivo – septické stavy, funkční stav při onemocnění, stimulace in vivo a produkce in vitro

33. Metody stanovení • Chemiluminiscence – IL-10, IL-6 • Bead Array Systém – průtoková cytometrie • ELISA • ELISPOT • mRNA – klidový stav, aktivace

35. Indikace vyšetření • Sérum – IL-6,8,10 – SIRS, trauma, sepse • Ex vivo produkce TNF – sepse • Lokálně – zánětlivá onemocnění

36. Metody stanovení • Produkce v supernatantu – ELISA • ELISPOT Enzyme – linked Immunospot Assay • Principem metody je vazba cytokinu produkovaného specifickou buňkou na protilátku vázanou na destičku

37. ELISPOT • Použití periferních mononukleárních buněk • Specifická stimulace studovaných buněk odpovídajícím stimulem po dobu, která je nutná pro prezentaci antigenu • Inkubace PBMC s antigenem(bílkovina, peptid), poté přenos aktivovaných T lymfocytů na mikrotitrační destičky • Po inkubaci (6-24 hodin) jsou buňky lyzovány, odmyty a přidána biotinem značená druhá protilátka proti testovanému antigenu • Detekce pomocí streptavidinu konjugovaného s křenovou peroxidázou

39. ELISPOT • Vyhodnocení – inverzní mikroskop • ELISPOT reader – digitální analýza obrazu • Detekce a kvantifikace specif. T lymfocytů v periferní krvi • Sledování průběhu nemoci • Sledování vlivu léků na produkci cytokinů in vitro • Autoimunita, transplantace